304 මල නොබැඳෙන වානේ දඟර නල රසායනික සංරචකය, SPACA6 ectodomain හි ව්‍යුහය ගැමෙට් විලයනයට සම්බන්ධ ප්‍රෝටීන වල සංරක්ෂණය කළ සුපිරි පවුලක් අඩංගු වේ.

Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ සීමිත CSS සහය ඇති බ්‍රවුසර අනුවාදයක් භාවිතා කරයි.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන කළ බ්‍රවුසරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා ප්‍රකාරය අක්‍රිය කරන්න).ඊට අමතරව, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාසිතා සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය පෙන්වමු.
එක් ස්ලයිඩයකට ලිපි තුනක් පෙන්වන ස්ලයිඩර්.ස්ලයිඩ හරහා ගමන් කිරීමට පසුපස සහ ඊළඟ බොත්තම් භාවිතා කරන්න, එක් එක් විනිවිදක හරහා ගමන් කිරීමට අවසානයේ ඇති ස්ලයිඩ පාලක බොත්තම් භාවිතා කරන්න.

SPACA6 යනු ශුක්‍රාණු-ප්‍රකාශිත මතුපිට ප්‍රෝටීනයක් වන අතර එය ක්ෂීරපායී ලිංගික ප්‍රජනනයේදී ගැමෙට් විලයන සඳහා ඉතා වැදගත් වේ.මෙම මූලික කාර්යභාරය තිබියදීත්, SPACA6 හි නිශ්චිත කාර්යය දුර්වල ලෙස වටහාගෙන ඇත.අපි SPACA6 හි බාහිර සෛල වසමෙහි ස්ඵටික ව්‍යුහය 2.2 Å විභේදනයකින් පැහැදිලි කරන්නෙමු, අර්ධ-නම්‍යශීලී සම්බන්ධක මගින් සම්බන්ධ කරන ලද නූල් හතරක මිටියක් සහ Ig-වැනි β-සැන්ඩ්විච් වලින් සමන්විත ද්වි-වසම් ප්‍රෝටීනයක් හෙළි කරයි.මෙම ව්‍යුහය IZUMO1, තවත් ගැමට් විලයන ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීනයකට සමාන වන අතර, SPACA6 සහ IZUMO1 සංසේචන ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීනවල සුපිරි පවුලෙහි ආරම්භක සාමාජිකයින් බවට පත් කරයි.IST සුපිරි පවුල ව්‍යුහාත්මකව නිර්වචනය කර ඇත්තේ එහි ඇඹරුණු හතර-හෙලික්ස් මිටියක් සහ ඩයිසල්ෆයිඩ්-සම්බන්ධිත CXXC මෝස්තර යුගලයක් මගිනි.මානව ප්‍රෝටියෝමයේ ව්‍යුහය මත පදනම් වූ ඇල්ෆා ෆෝල්ඩ් සෙවුමක් මෙම සුපිරි පවුලේ අතිරේක ප්‍රෝටීන් සාමාජිකයන් හඳුනාගෙන ඇත;විශේෂයෙන්, මෙම ප්‍රෝටීන බොහොමයක් ගැමේට් විලයනයට සම්බන්ධ වේ.SPACA6 ව්‍යුහය සහ IST superfamily හි අනෙකුත් සාමාජිකයන් සමඟ එහි ඇති සම්බන්ධය ක්ෂීරපායී ගැමට් විලයනය පිළිබඳ අපගේ දැනුමේ නැතිවූ සබැඳිය සපයයි.
සෑම මිනිස් ජීවිතයක්ම ආරම්භ වන්නේ වෙනම හැප්ලොයිඩ් ගේමට් දෙකකින් ය: පියාගේ ශුක්‍රාණු සහ මවගේ බිත්තරය.මෙම ශුක්‍රාණුව කාන්තා ලිංගික පත්‍රිකාව හරහා මිලියන ගණනක් ශුක්‍රාණු සෛල ගමන් කර විවිධ බාධක ජයගෙන ධාරණාවකට භාජනය වන තීව්‍ර තේරීම් ක්‍රියාවලියක ජයග්‍රාහකයා වන අතර එමඟින් ඒවායේ චලනය සහ මතුපිට සංරචක 2,3,4 ක්‍රියාවලිය වැඩි දියුණු කරයි.ශුක්‍රාණු සහ ඕසයිට් එකිනෙක සොයා ගත්තද ක්‍රියාවලිය තවම අවසන් වී නැත.Oocyte සමුච්චිත සෛල ස්ථරයකින් සහ zona pellucida නම් ග්ලයිකොප්‍රෝටීන් බාධකයකින් වට වී ඇති අතර, ශුක්‍රාණු බිත්තරයට ඇතුළු වීමට ශුක්‍රාණු ගමන් කළ යුතුය.Spermatozoa මෙම අවසාන බාධක ජය ගැනීම සඳහා මතුපිට ඇලවුම් අණු සහ පටල ආශ්‍රිත සහ ස්‍රාවය වන එන්සයිම වල එකතුවක් භාවිතා කරයි.මෙම අණු සහ එන්සයිම ප්‍රධාන වශයෙන් අභ්‍යන්තර පටලයේ සහ ඇක්‍රොසෝමල් න්‍යාසයේ ගබඩා කර ඇති අතර ඇක්‍රොසෝමල් ප්‍රතික්‍රියාවේදී ශුක්‍රාණුවේ පිටත පටලය ලයිස් කළ විට අනාවරණය වේ.මෙම තීව්‍ර ගමනේ අවසාන පියවර වනුයේ ශුක්‍රාණු-බිත්තර විලයන සිදුවීමයි, එහිදී සෛල දෙක තම පටල විලයනය කර තනි ඩිප්ලොයිඩ් ජීවියෙකු බවට පත්වේ.මෙම ක්‍රියාවලිය මානව ප්‍රජනනයෙහි පෙරළිකාර වුවද, අවශ්‍ය අණුක අන්තර්ක්‍රියා දුර්වල ලෙස වටහාගෙන ඇත.
ගැමට් වල සංසේචනයට අමතරව, ලිපිඩ ද්වී ස්ථර දෙකක විලයනයේ රසායන විද්‍යාව පුළුල් ලෙස අධ්‍යයනය කර ඇත.සාමාන්‍යයෙන්, පටල විලයනය යනු ශක්තිමය වශයෙන් අහිතකර ක්‍රියාවලියක් වන අතර, ප්‍රෝටීන් උත්ප්‍රේරකයක් ව්‍යුහාත්මක අනුරූප වෙනසක් සිදු කිරීමට අවශ්‍ය වන අතර එමඟින් පටල දෙකක් සමීප කර, ඒවායේ අඛණ්ඩතාව බිඳී විලයනය 8,9 ඇති කරයි.මෙම ප්‍රෝටීන් උත්ප්‍රේරක fusogens ලෙස හඳුන්වන අතර ගණන් කළ නොහැකි විලයන පද්ධතිවල සොයාගෙන ඇත.ධාරක සෛල තුළට වෛරස් ඇතුළුවීම සඳහා (උදා: HIV-1 හි gp160, කොරෝනා වයිරස් වල ස්පයික්, ඉන්ෆ්ලුවෙන්සා වෛරස් වල hemagglutinin)10,11,12 වැදෑමහ (සින්සයිටින්)13,14,15 සහ පහළ යුකැරියෝට් වල ගැමේට් සාදන විලයන ( ශාක, ප්‍රොටිස්ට් සහ ආත්‍රපෝඩා වල HAP2/GCS1) 16,17,18,19.ප්‍රෝටීන කිහිපයක් ගැමේට් ඇමිණීම සහ විලයනය සඳහා තීරනාත්මක බව පෙන්වා දී ඇතත්, මිනිස් ගැමට් සඳහා ෆියුසෝජන් තවමත් සොයාගෙන නොමැත.මූසිකය සහ මිනිස් ගැමට් විලයනයට අවශ්‍ය ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ප්‍රෝටීනයක් වන ඕසයිට්-ප්‍රකාශිත CD9 21,22,23 මුලින්ම සොයා ගන්නා ලදී.එහි නිරවද්‍ය ක්‍රියාකාරිත්වය නොපැහැදිලිව පැවතුනද, මැලියම්වල කාර්යභාරයක්, බිත්තර ක්ෂුද්‍රවිලි මත ඇලවීමේ ව්‍යුහය සහ/හෝ ඕසයිට් මතුපිට ප්‍රෝටීන වල නිවැරදි ස්ථානගත කිරීම 24,25,26 විය හැකිය.ගැමෙට් විලයනය සඳහා ඉතා වැදගත් වන සාමාන්‍ය ප්‍රෝටීන දෙක වන්නේ ශුක්‍රාණු ප්‍රෝටීන් IZUMO127 සහ ඕසයිට් ප්‍රෝටීන් JUNO28 වන අතර, ඒවායේ අන්‍යෝන්‍ය ආශ්‍රය ගැමෙට් හඳුනාගැනීමේ සහ විලයනයට පෙර ඇලීමෙහි වැදගත් පියවරකි.පිරිමි Izumo1 knockout මීයන් සහ ගැහැණු Juno knockout මීයන් සම්පූර්ණයෙන්ම වඳ වේ, මෙම මාදිලිවල ශුක්‍රාණු පෙරිවිටලයින් අවකාශයට ඇතුළු වන නමුත් ගැමට් විලයන නොවේ.ඒ හා සමානව, මානව සංසේචන පරීක්ෂණවලදී ගැමට් වලට ප්‍රති-IZUMO1 හෝ JUNO27,29 ප්‍රතිදේහ සමඟ ප්‍රතිකාර කළ විට සංඝටනය අඩු විය.
මෑතකදී, IZUMO1 සහ JUNO20,30,31,32,33,34,35 ට සමාන ශුක්‍රාණු ප්‍රකාශිත ප්‍රෝටීන සමූහයක් අලුතින් සොයා ගෙන ඇත.ශුක්‍රාණු ඇක්‍රොසෝමල් පටල ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන් 6 (SPACA6) සංසේචනය සඳහා අත්‍යවශ්‍ය බව මහා පරිමාණ මුරීන් විකෘති අධ්‍යයනයකදී හඳුනාගෙන ඇත.මෙම ශුක්‍රාණු perivitelline අවකාශයට රිංගා ගත්තද, Spaca6 ජානය තුළට ට්‍රාන්ස්ජීන් ඇතුල් කිරීම මගින් විලයනය කළ නොහැකි ශුක්‍රාණු නිපදවයි.මීයන් තුළ පසුව සිදු කරන ලද knockout අධ්‍යයනයන් මගින් Spaca6 ගැමට් විලයන 30,32 සඳහා අවශ්‍ය බව තහවුරු විය.SPACA6 වෘෂණවල තනිකරම ප්‍රකාශ වන අතර IZUMO1 ට සමාන ප්‍රාදේශීයකරණ රටාවක් ඇත, එනම් ඇක්‍රොසෝමල් ප්‍රතික්‍රියාවට පෙර ශුක්‍රාණු වල ඉන්ටිමාව තුළ, පසුව ඇක්‍රොසෝමල් ප්‍රතික්‍රියා 30,32 ට පසුව සමක කලාපයට සංක්‍රමණය වේ.Spaca6 සමලිංගික විවිධ ක්ෂීරපායීන් සහ අනෙකුත් යුකැරියෝටේ 30 තුළ පවතින අතර SPACA6 30 ට ප්‍රතිරෝධය මගින් vitro හි මානව සංසේචනය නිෂේධනය කිරීම මගින් මානව ගැමට් විලයනය සඳහා එහි වැදගත්කම පෙන්නුම් කර ඇත.IZUMO1 සහ JUNO මෙන් නොව, SPACA6 හි ව්‍යුහය, අන්තර්ක්‍රියා සහ ක්‍රියාකාරීත්වය පිළිබඳ විස්තර අපැහැදිලිව පවතී.
මානව ශුක්‍රාණු සහ ඩිම්බ විලයනයට පාදක වන මූලික ක්‍රියාවලිය වඩාත් හොඳින් අවබෝධ කර ගැනීම සඳහා, පවුල් සැලසුම්කරණයේ සහ සාරවත් ප්‍රතිකාරයේ අනාගත වර්ධනයන් පිළිබඳව අපට දැනුම් දීමට හැකි වන පරිදි, අපි SPACA6 ව්‍යුහාත්මක හා ජෛව රසායනික අධ්‍යයනයන් සිදු කළෙමු.SPACA6 හි බාහිර සෛල වසමෙහි ස්ඵටික ව්‍යුහය, අර්ධ-නම්‍යශීලී කලාප මගින් සම්බන්ධ කර ඇති සිව්-හෙල්කල් බණ්ඩලයක් (4HB) සහ immunoglobulin වැනි (Ig-වැනි) වසමක් පෙන්වයි.පෙර අධ්‍යයනයන්හි පුරෝකථනය කර ඇති පරිදි, 7,32,37 SPACA6 හි වසම් ව්‍යුහය මානව IZUMO1 ට සමාන වන අතර ප්‍රෝටීන දෙක අසාමාන්‍ය මෝස්තරයක් බෙදා ගනී: 4HB ත්‍රිකෝණාකාර හෙලික්සීය මතුපිටක් සහ ඩයිසල්ෆයිඩ්-සම්බන්ධිත CXXC මෝස්තර යුගලයක් සමඟ.අපි යෝජනා කරන්නේ IZUMO1 සහ SPACA6 දැන් ගැමේට් විලයනයට සම්බන්ධ ප්‍රෝටීන වල විශාල, ව්‍යුහාත්මකව සම්බන්ධ සුපිරි පවුලක් නිර්වචනය කරන බවයි.සුපිරි පවුලට අනන්‍ය වූ විශේෂාංග භාවිතා කරමින්, අපි AlphaFold ව්‍යුහාත්මක මානව ප්‍රෝටියෝමය සඳහා පුළුල් සෙවීමක් සිදු කළෙමු, මෙම සුපිරි පවුලේ අමතර සාමාජිකයින් හඳුනා ගනිමින්, ගැමේට් විලයනයට සහ/හෝ සංසේචනයට සම්බන්ධ සාමාජිකයින් කිහිප දෙනෙකු ද ඇතුළුව.ගැමේට් විලයනයට සම්බන්ධ ප්‍රෝටීන වල පොදු ව්‍යුහාත්මක ගුණයක් සහ සුපිරි පවුලක් ඇති බව දැන් පෙනී යන අතර අපගේ ව්‍යුහය මානව ගැමට් විලයන යාන්ත්‍රණයේ මෙම වැදගත් අංගයේ අණුක සිතියමක් සපයයි.
SPACA6 යනු N-සම්බන්ධිත ග්ලයිකාන් එකක් සහ පුටින් ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන හයක් සහිත තනි-පාස් ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ප්‍රෝටීනයකි (Figures S1a සහ S2).අපි Drosophila S2 සෛල තුළ මානව SPACA6 (අපද්‍රව්‍ය 27-246) හි බාහිර සෛලීය වසම ප්‍රකාශ කළ අතර නිකල් සම්බන්ධතාවය, කැටායන හුවමාරුව සහ ප්‍රමාණය බැහැර කිරීමේ වර්ණදේහ (Fig. S1b) භාවිතයෙන් ප්‍රෝටීනය පිරිසිදු කළෙමු.පිරිසිදු කරන ලද SPACA6 ectodomain ඉතා ස්ථායී සහ සමජාතීය වේ.බහුඅස්‍ර ආලෝක විසිරීම (SEC-MALS) සමඟ ඒකාබද්ධ වූ ප්‍රමාණයේ බැහැර කිරීමේ වර්ණදේහ භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය 26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c) හි ගණනය කළ අණුක බරක් සහිත එක් උච්චයක් අනාවරණය විය.මෙය SPACA6 monomeric ectodomain ප්‍රමාණයට අනුකූල වන අතර, පිරිසිදු කිරීමේදී ඔලිගොමරීකරණය සිදු නොවූ බව පෙන්නුම් කරයි.මීට අමතරව, වෘත්තාකාර ඩයික්‍රොයිස් (CD) වර්ණාවලීක්ෂය මගින් 51.3 °C ද්රවාංකයක් සහිත මිශ්‍ර α/β ව්‍යුහයක් අනාවරණය විය (රූපය S1d,e).සීඩී වර්ණාවලියේ විසංයෝජනය 38.6% α-හෙලික්සීය සහ 15.8% β-කෙටි මූලද්‍රව්‍ය අනාවරණය විය (රූපය S1d).
SPACA6 ectodomain සසම්භාවී matrix seeding38 භාවිතයෙන් ස්ඵටිකීකරණය කරන ලද අතර එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස 2.2 Å විභේදනයක් සහිත දත්ත කට්ටලයක් (වගුව 1 සහ රූපය S3).ව්‍යුහ නිර්ණය සඳහා බ්‍රෝමයිඩ් නිරාවරණය සහිත කොටස් මත පදනම් වූ අණුක ආදේශක සහ SAD අවධි දත්තවල එකතුවක් භාවිතා කරමින් (වගුව 1 සහ රූපය S4), අවසාන පිරිපහදු කළ ආකෘතිය 27-246 අවශේෂ වලින් සමන්විත වේ.ව්‍යුහය නිර්ණය කරන විට, පර්යේෂණාත්මක හෝ ඇල්ෆාෆෝල්ඩ් ව්‍යුහයන් නොතිබුණි.SPACA6 ectodomain මනින 20 Å × 20 Å × 85 Å, හීලිස් හතක් සහ β-කෙඳි නවයකින් සමන්විත වන අතර, ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන හයකින් ස්ථායීකරණය කරන ලද දිගු තෘතීය ගුණයකින් යුක්ත වේ (රූපය 1a, b).Asn243 පැති දාමයේ අවසානයේ ඇති දුර්වල ඉලෙක්ට්‍රෝන ඝනත්වය පෙන්නුම් කරන්නේ මෙම අවශේෂය N-සම්බන්ධිත ග්ලයිකෝසයිලීකරණයක් බවයි.ව්‍යුහය වසම් දෙකකින් සමන්විත වේ: N-පර්යන්ත හතර-හෙලික්ස් බණ්ඩලය (4HB) සහ C-පර්යන්ත Ig-වැනි වසම අතර අතරමැදි hinge කලාපයක් (පය. 1c).
SPACA6 හි බාහිර සෛල වසමෙහි ව්‍යුහයක්.SPACA6 හි බාහිර සෛල වසමෙහි තීරු රූප සටහන, N සිට C-terminus දක්වා දාමයේ වර්ණය තද නිල් සිට තද රතු දක්වා.ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධනවලට සම්බන්ධ සයිස්ටයින් මැජෙන්ටා වලින් උද්දීපනය කෙරේ.b SPACA6 හි බාහිර සෛල වසමෙහි ස්ථල විද්‍යාව.රූප සටහන 1a හි ඇති වර්ණ පටිපාටියම භාවිතා කරන්න.c SPACA6 බාහිර සෛල වසම.4HB, hinge, සහ Ig වැනි වසම් තීරු ප්‍රස්ථාර පිළිවෙලින් තැඹිලි, කොළ සහ නිල් වර්ණවලින් යුක්ත වේ.ස්ථර පරිමාණයට ඇදගෙන නැත.
SPACA6 හි 4HB වසමට ප්‍රධාන හෙලික්ස් හතරක් (හෙලික්ස් 1-4) ඇතුළත් වන අතර ඒවා හෙලික්සීය හෙලික්ස් (රූපය 2a) ආකාරයෙන් සකස් කර ඇත, ප්‍රති-සමාන්තර සහ සමාන්තර අන්තර්ක්‍රියා අතර ප්‍රත්‍යාවර්ත වේ (රූපය 2b).කුඩා අමතර තනි හැරවුම් හෙලික්සයක් (helix 1′) මිටියට ලම්බකව තබා, 1 සහ 2 හෙලිස් සහිත ත්‍රිකෝණයක් සාදයි. මෙම ත්‍රිකෝණය සාපේක්ෂ වශයෙන් ඝනැති හෙලික්ස් 3 සහ 4 ඇසුරුම්වල හෙලික්සීය ඇඹරුම් ඇසුරුම්වල තරමක් විකෘති වී ඇත ( රූපය 2a).
4HB N-පර්යන්ත තීරු සටහන.b හෙලික්ස් හතරක මිටියක ඉහළ දසුන, සෑම හෙලික්ස් එකක්ම N-පර්යන්තයේ තද නිල් පැහැයෙන් සහ C-පර්යන්තයේ තද රතු පැහැයෙන් උද්දීපනය කර ඇත.c 4HB සඳහා ඉහළ-පහළ සර්පිලාකාර රෝද රූප සටහන, සෑම අවශේෂයක්ම තනි අකුරු ඇමයිනෝ අම්ල කේතයකින් ලේබල් කර ඇති කවයක් ලෙස පෙන්වයි;රෝදයේ මුදුනේ ඇති ඇමයිනෝ අම්ල හතර පමණක් අංකනය කර ඇත.ධ්‍රැවීය නොවන අපද්‍රව්‍ය කහ පැහැයෙන් යුක්ත වන අතර ධ්‍රැවීය ආරෝපිත අපද්‍රව්‍ය කොළ පැහැයෙන් ද ධන ආරෝපිත අපද්‍රව්‍ය නිල් පැහැයෙන් ද සෘණ ආරෝපිත අපද්‍රව්‍ය රතු පැහැයෙන් ද වර්ණ ගන්වයි.d 4HB වසමෙහි ත්‍රිකෝණාකාර මුහුණු, 4HB තැඹිලි පැහැයෙන් සහ සරනේරු කොළ පැහැයෙන්.ඇතුළු කිරීම් දෙකම සැරයටි හැඩැති ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන පෙන්වයි.
4HB ප්‍රධාන වශයෙන් අලිපේර සහ ඇරෝමැටික අපද්‍රව්‍ය වලින් සමන්විත අභ්‍යන්තර ජලභීතික හරයක් මත සංකේන්ද්‍රණය වේ (රූපය 2c).මධ්‍යයේ Cys41 සහ Cys55 අතර ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධනයක් අඩංගු වන අතර එය හෙලිස් 1 සහ 2 ඉහළ උස් වූ ත්‍රිකෝණයක සම්බන්ධ කරයි (රූපය 2d).Helix 1′ හි CXXC motif සහ hinge කලාපයේ β-hairpin කෙළවරේ ඇති CXXC මෝස්තරය අතර අමතර ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන දෙකක් සෑදී ඇත (රූපය 2d).නොදන්නා ශ්‍රිතයක් (Arg37) සහිත කොන්සර්වේටිව් ආර්ජිනින් අපද්‍රව්‍ය 1′, 1, සහ 2 හෙලිස් මගින් සාදන ලද හිස් ත්‍රිකෝණයක් තුළ පිහිටා ඇත. Aliphatic කාබන් පරමාණු Cβ, Cγ සහ Cδ Arg37 හයිඩ්‍රොෆෝබික් හරය සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන අතර එහි ගුවානඩින් කාණ්ඩ චක්‍රීය ලෙස චලනය වේ. හෙලිස් 1′ සහ 1 අතර Thr32 කොඳු නාරටිය සහ පැති දාමය අතර අන්තර්ක්‍රියා හරහා (Fig. S5a,b).Tyr34 කුහරය තුළට විහිදෙන කුඩා කුහර දෙකක් ඉතිරි වන අතර එමඟින් Arg37 ද්‍රාවකය සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කළ හැකිය.
Ig-සමාන β-සැන්ඩ්විච් වසම් යනු හයිඩ්‍රොෆෝබික් හරයක් හරහා අන්තර්ක්‍රියා කරන බහු-තන්තු සහිත උභයපති β-ෂීට් දෙකක හෝ වැඩි ගණනක පොදු ලක්ෂණය බෙදා ගන්නා ප්‍රෝටීන වල විශාල සුපිරි පවුලකි. SPACA6 හි C-පර්යන්ත Ig-වැනි වසම එකම රටාවක් ඇත. සහ ස්ථර දෙකකින් සමන්විත වේ (රූපය S6a).ෂීට් 1 යනු කෙඳි හතරක (D, F, H, සහ I කෙඳි) β-පත්‍රයකි, එහිදී F, H සහ I යන නූල් ප්‍රති-සමාන්තර සැකැස්මක් සාදන අතර I සහ D කෙඳි සමාන්තර අන්තර්ක්‍රියාවක් ගනී.වගුව 2 යනු කුඩා ප්‍රති-සමාන්තර ද්විත්ව නූල් සහිත බීටා පත්‍රයකි (කෙඳි E සහ G).E දාමයේ C-පර්යන්තය සහ H දාමයේ කේන්ද්‍රය (Cys170-Cys226) අතර අභ්‍යන්තර ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධනයක් නිරීක්ෂණය විය (රූපය S6b).මෙම ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධනය immunoglobulin40,41 හි β-සැන්ඩ්විච් වසමේ ඇති ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධනයට සමාන වේ.
නූල් හතරකින් යුත් β-පත්‍රය එහි සම්පූර්ණ දිග දිගේ ඇඹරී, හැඩයෙන් සහ විද්‍යුත් ස්ථිතිකයෙන් වෙනස් වන අසමමිතික දාර සාදයි.තුනී දාරය යනු SPACA6 හි ඉතිරිව ඇති අසමාන සහ විද්‍යුත් ස්ථිතික විවිධ පෘෂ්ඨ හා සසඳන විට කැපී පෙනෙන පැතලි ජලභීතික පාරිසරික මතුපිටකි (Fig. S6b,c).නිරාවරණ කොඳු නාරටිය කාබොනයිල්/ඇමයිනෝ කාණ්ඩ සහ ධ්‍රැවීය පැති දාමවල ප්‍රවාහයක් හයිඩ්‍රොෆෝබික් මතුපිට වටා ඇත (රූපය S6c).පුළුල් ආන්තිකය ආවරණය කරන ලද හෙලික්සීය කොටසකින් ආවරණය වී ඇති අතර එය හයිඩ්‍රොෆෝබික් හරයේ N-පර්යන්ත කොටස අවහිර කරන අතර F දාමයේ කොඳු නාරටියේ විවෘත ධ්‍රැවීය කාණ්ඩය සමඟ හයිඩ්‍රජන් බන්ධන තුනක් සාදයි (රූපය S6d).මෙම දාරයේ C-පර්යන්ත කොටස අර්ධ වශයෙන් නිරාවරණය වන ජලභීතික හරයක් සහිත විශාල සාක්කුවක් සාදයි.ද්විත්ව ආර්ජිනින් අපද්‍රව්‍ය කට්ටල තුනක් (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 සහ Arg212-Arg214) සහ මධ්‍යම හිස්ටයිඩින් (His220) (Figure S6e) නිසා සාක්කුව ධන ආරෝපණ වලින් වටවී ඇත.
hinge කලාපය යනු හෙලික්සීය වසම සහ Ig-වැනි වසම අතර කෙටි කොටසකි, එක ප්‍රති-සමාන්තර තුනකින් යුත් β-ස්ථරයකින් (තන්තු A, B සහ C), කුඩා 310 හෙලික්ස් සහ දිගු අහඹු හෙලික්සීය කොටස් කිහිපයකින් සමන්විත වේ.(රූපය S7).hinge කලාපයේ සහසංයුජ සහ විද්‍යුත් ස්ථිතික සම්බන්ධතා ජාලයක් 4HB සහ Ig-වැනි වසම අතර දිශානතිය ස්ථාවර කරන බව පෙනේ.ජාලය කොටස් තුනකට බෙදිය හැකිය.පළමු කොටසට CXXC මෝස්තර දෙකක් (27CXXC30 සහ 139CXXC142) ඇතුළත් වන අතර එය hinge හි β-hairpin සහ 4HB හි 1′ හෙලික්ස් අතර ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන යුගලයක් සාදයි.දෙවන කොටසට Ig-like domain සහ hinge අතර විද්‍යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්‍රියා ඇතුළත් වේ.hinge හි Glu132 Ig වැනි වසමෙහි Arg233 සහ hinge හි Arg135 සමඟ ලුණු පාලමක් සාදයි.තුන්වන කොටස Ig වැනි වසම සහ hinge කලාපය අතර සහසංයුජ බන්ධනයක් ඇතුළත් වේ.ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන දෙකක් (Cys124-Cys147 සහ Cys128-Cys153) Gln131 සහ කොඳු නාරටිය ක්‍රියාකාරී කණ්ඩායම අතර විද්‍යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්‍රියා මගින් ස්ථායී වන සම්බන්ධකයකට hinge loop සම්බන්ධ කරයි, පළමු Ig වැනි වසම වෙත ප්‍රවේශ වීමට ඉඩ සලසයි.දාමය.
SPACA6 ectodomain හි ව්‍යුහය සහ 4HB සහ Ig වැනි වසම් වල තනි ව්‍යුහයන් ප්‍රෝටීන් දත්ත සමුදායන් 42 හි ව්‍යුහාත්මකව සමාන වාර්තා සෙවීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී.අපි ඉහළ Dali Z ලකුණු, කුඩා සම්මත අපගමනය සහ විශාල LALI ලකුණු සහිත ගැළපීම් හඳුනා ගත්තෙමු (දෙවැන්න ව්‍යුහාත්මකව සමාන අපද්‍රව්‍ය ගණනයි).සම්පූර්ණ ectodomain සෙවුමෙන් (වගුව S1) පළමු පහරවල් 10 සඳහා පිළිගත හැකි Z-ලකුණු >842ක් තිබුණද, 4HB හෝ Ig-වැනි වසම සඳහා පමණක් සෙවීමේදී පෙන්නුම් කළේ මෙම පහරවල් බොහොමයක් β-සැන්ඩ්විච් වලට පමණක් අනුරූප වන බවයි.බොහෝ ප්‍රෝටීන වල ඇති සර්වසම්පූර්ණ ගුණයක්.Dali හි සෙවුම් තුනම ලබා දුන්නේ එක් ප්‍රතිඵලයක් පමණි: IZUMO1.
SPACA6 සහ IZUMO1 ව්‍යුහාත්මක සමානකම්7,32,37 බෙදාහදා ගන්නා බව බොහෝ කලක සිට යෝජනා කර ඇත.මෙම ගැමේට් විලයන ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන දෙකෙහි ectodomains බෙදාගන්නේ 21% අනුක්‍රමික අනන්‍යතාවයක් පමණි (Figure S8a), සංරක්‍ෂිත ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන රටාවක් සහ SPACA6 හි පුරෝකථනය කරන ලද C-පර්යන්ත Ig වැනි වසම ඇතුළු සංකීර්ණ සාක්ෂි, එය ගොඩනැගීමට මුල් උත්සාහයන්ට ඉඩ ලබා දුන්නේය. IZUMO1 සැකිල්ලක් ලෙස භාවිතා කරමින් A SPACA6 මූසිකයේ සම විද්‍යා ආකෘතිය37.අපගේ ව්‍යුහය මෙම අනාවැකි සනාථ කරන අතර සැබෑ සමානකම පෙන්නුම් කරයි.ඇත්ත වශයෙන්ම, SPACA6 සහ IZUMO137,43,44 ව්‍යුහයන් සමාන 4HB සහ Ig වැනි β-සැන්ඩ්විච් වසම් සමඟ hinge කලාපයක් (පය. S8c) සම්බන්ධ කර ඇති එකම වසම් දෙකේ ගෘහ නිර්මාණ ශිල්පය (Fig. S8b) බෙදා ගනී.
IZUMO1 සහ SPACA6 4HB සාම්ප්‍රදායික සර්පිලාකාර මිටි වලින් පොදු වෙනස්කම් ඇත.සාමාන්‍ය 4HBs, එන්ඩෝසෝම විලයනය 45,46 සඳහා සම්බන්ධ SNARE ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණවල ඇති ඒවා මෙන්, මධ්‍යම අක්ෂය වටා නියත වක්‍රයක් පවත්වා ගනිමින් ඒකාකාර පරතරයකින් යුත් හෙලික ඇත 47. ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, IZUMO1 සහ SPACA6 යන දෙකෙහිම හෙලික්සීය වසම් විචල්‍ය වක්‍රතාවයකින් සහ විකෘති වී ඇත. අසමාන ඇසුරුම් (රූපය S8d).1′, 1 සහ 2 හෙලිස් මගින් සාදන ලද ත්‍රිකෝණය නිසා ඇති විය හැකි පෙරළිය, IZUMO1 සහ SPACA6 හි රඳවා ඇති අතර හෙලික්ස් 1′ මත එකම CXXC මෝස්තරය මගින් ස්ථාවර වේ.කෙසේ වෙතත්, SPACA6 හි ඇති අමතර ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධනය (Cys41 සහ Cys55 සහසංයුජ හෙලිස් 1 සහ 2 ඉහතින් සම්බන්ධ කරයි) ත්‍රිකෝණ අග්‍රයේ තියුණු අග්‍රයක් නිර්මාණය කරයි, SPACA6 වඩාත් උච්චාරණ කුහර ත්‍රිකෝණ සහිත IZUMO1 ට වඩා විකෘති කරයි.මීට අමතරව, SPACA6 හි මෙම කුහරයේ මධ්‍යයේ නිරීක්ෂණය කරන ලද IZUMO1 හි Arg37 නොමැත.ඊට වෙනස්ව, IZUMO1 සතුව අලිපේර සහ ඇරෝමැටික අපද්‍රව්‍යවල වඩාත් සාමාන්‍ය ජලභීතික හරයක් ඇත.
IZUMO1 සතුව Ig-වැනි වසමක් ඇති අතර එය ද්විත්ව කෙඳි සහිත සහ පස්-තට්ටු සහිත β-sheet43කින් සමන්විත වේ.IZUMO1 හි ඇති අමතර නූල් SPACA6 හි ඇති දඟරය ප්‍රතිස්ථාපනය කරයි, එය කෙඳි තුළ කොඳු ඇට පෙළේ හයිඩ්‍රජන් බන්ධන සීමා කිරීමට F තන්තුව සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරයි.සංසන්දනය කිරීමේ සිත්ගන්නා කරුණක් වන්නේ ප්‍රෝටීන දෙකේ Ig වැනි වසම්වල පුරෝකථනය කළ මතුපිට ආරෝපණයයි.IZUMO1 පෘෂ්ඨය SPACA6 මතුපිටට වඩා සෘණ ආරෝපණය වේ.අමතර ආරෝපණයක් ශුක්‍රාණු පටලයට මුහුණලා C-terminus අසල පිහිටා ඇත.SPACA6 හි, එම කලාප වඩාත් මධ්‍යස්ථ හෝ ධන ආරෝපිත විය (Fig. S8e).උදාහරණයක් ලෙස, SPACA6 හි හයිඩ්‍රොෆෝබික් මතුපිට (තුනී දාර) සහ ධන ආරෝපිත වලවල් (පුළුල් දාර) IZUMO1 හි සෘණ ආරෝපණය වේ.
IZUMO1 සහ SPACA6 අතර සම්බන්ධතාව සහ ද්විතියික ව්‍යුහ මූලද්‍රව්‍ය හොඳින් සංරක්ෂණය වී ඇතත්, Ig වැනි වසම්වල ව්‍යුහාත්මක පෙළගැස්ම පෙන්නුම් කළේ වසම් දෙක එකිනෙකට සාපේක්ෂව සාමාන්‍ය දිශානතියේ වෙනස් වන බවයි (රූපය S9).IZUMO1 හි සර්පිලාකාර බණ්ඩලය β-සැන්ඩ්විච් වටා වක්‍ර වී ඇති අතර, මධ්‍යම අක්ෂයේ සිට 50° පමණ වන විට කලින් විස්තර කළ "බූමරන්ග්" හැඩය නිර්මාණය කරයි.ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, SPACA6 හි හෙලික්සීය කදම්භය ප්‍රතිවිරුද්ධ දිශාවට 10° පමණ ඇලවී ඇත.මෙම දිශානතියේ වෙනස්කම් hinge කලාපයේ වෙනස්කම් නිසා විය හැක.ප්‍රාථමික අනුක්‍රමික මට්ටමේදී, cysteine, glycine සහ aspartic අම්ල අපද්‍රව්‍ය හැර, IZUMO1 සහ SPACA6 සරනේරුවෙහි කුඩා අනුක්‍රමික සමානකමක් බෙදා ගනී.එහි ප්රතිඵලයක් ලෙස හයිඩ්රජන් බන්ධන සහ විද්යුත්ස්ථිති ජාල සම්පූර්ණයෙන්ම වෙනස් වේ.β-පත්‍ර ද්විතියික ව්‍යුහ මූලද්‍රව්‍ය IZUMO1 සහ SPACA6 විසින් බෙදා ගනු ලැබේ, නමුත් IZUMO1 හි දාම බොහෝ දිගු වන අතර 310 helix (helix 5) SPACA6 ට අනන්‍ය වේ.මෙම වෙනස්කම් වෙනත් ආකාරයකින් සමාන ප්‍රෝටීන දෙකක් සඳහා විවිධ වසම් දිශානතිය ඇති කරයි.
අපගේ Dali සේවාදායක සෙවීමේදී අනාවරණය වූයේ මෙම විශේෂිත 4HB ගුණයකින් (වගුව S1) ඇති ප්‍රෝටීන් දත්ත ගබඩාවේ ගබඩා කර ඇති පර්යේෂණාත්මකව තීරණය කරන ලද ව්‍යුහයන් දෙක වන්නේ SPACA6 සහ IZUMO1 පමණක් බවයි.වඩාත් මෑතක දී, DeepMind (Alphabet/Google) විසින් AlphaFold, ප්‍රාථමික අනුපිළිවෙලින් ප්‍රෝටීන වල ත්‍රිමාණ ව්‍යුහයන් නිවැරදිව පුරෝකථනය කළ හැකි ස්නායු ජාල පදනම් කරගත් පද්ධතියක් නිපදවා ඇත.අපි SPACA6 ව්‍යුහය විසඳා ටික කලකට පසු, AlphaFold දත්ත සමුදාය නිකුත් කරන ලද අතර, මානව ප්‍රෝටියෝම්48,49 හි ඇති සියලුම ප්‍රෝටීන වලින් 98.5%ක් ආවරණය වන පරිදි අනාවැකි ව්‍යුහ ආකෘති සපයයි.අපගේ විසඳන ලද SPACA6 ව්‍යුහය සෙවුම් ආකෘතියක් ලෙස භාවිතා කරමින්, AlphaFold හියුමන් ප්‍රෝටියෝමයේ ආකෘතිය සඳහා වූ ව්‍යුහාත්මක සමලිංගික සෙවීමක් SPACA6 සහ IZUMO1 ට හැකි ව්‍යුහාත්මක සමානකම් ඇති අපේක්ෂකයින් හඳුනාගෙන ඇත.SPACA6 (Fig. S10a) පුරෝකථනය කිරීමේදී AlphaFold හි ඇදහිය නොහැකි නිරවද්‍යතාවය සැලකිල්ලට ගෙන-විශේෂයෙන් 1.1 Å rms ectodomain අපගේ විසඳන ලද ව්‍යුහය (Fig. S10b) හා සසඳන විට-හඳුනාගත් SPACA6 ගැලපීම් නිවැරදි විය හැකි බව අපට විශ්වාස කළ හැක.
මීට පෙර, PSI-BLAST වෙනත් ශුක්‍රාණු ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන තුනක් සමඟ IZUMO1 පොකුර සෙව්වේය: IZUMO2, IZUMO3, සහ IZUMO450.මෙම IZUMO පවුලේ ප්‍රෝටීන් Ig වැනි වසමක් නොමැති වුවද, IZUMO1 (Figure 3a සහ S11) හා සමාන ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන රටාවක් සහිත 4HB වසම තුළට නැමෙන බව AlphaFold අනාවැකි පළ කළේය.IZUMO2 සහ IZUMO3 යනු IZUMO1 ට සමාන ඒකපාර්ශ්වික පටල ප්‍රෝටීන බව උපකල්පනය කර ඇති අතර, IZUMO4 ස්‍රාවය වන බව පෙනේ.Gamete විලයනයෙහි IZUMO 2, 3, සහ 4 ප්‍රෝටීන වල ක්‍රියාකාරිත්වය තීරණය කර නොමැත.IZUMO3 ශුක්‍රාණු වර්ධනයේදී acrosome biogenesis හි කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බව දන්නා අතර IZUMO ප්‍රෝටීනය සංකීර්ණ 50ක් සාදන බව සොයාගෙන ඇත.ක්ෂීරපායින්, උරගයින් සහ උභයජීවීන් තුළ IZUMO ප්‍රෝටීන සංරක්ෂණය කිරීමෙන් ඇඟවෙන්නේ ඒවායේ විභව ක්‍රියාකාරිත්වය DCST1/2, SOF1 සහ FIMP වැනි අනෙකුත් දන්නා ගැමට් විලයන ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන සමඟ අනුකූල වන බවයි.
4HB, hinge, සහ Ig වැනි වසම් පිළිවෙලින් තැඹිලි, කොළ සහ නිල් පැහැයෙන් උද්දීපනය කර ඇති IST සුපිරි පවුලෙහි වසම් ගෘහ නිර්මාණ ශිල්පයේ රූප සටහන.IZUMO4 සතුව කළු පැහැති පෙනුමක් ඇති අද්විතීය C-පර්යන්ත කලාපයක් ඇත.තහවුරු කරන ලද සහ සැකසූ ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන පිළිවෙලින් ඝන සහ තිත් රේඛා මගින් පෙන්වනු ලැබේ.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYLF9), සහ DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) පැනල A ලෙස එකම වර්ණ පරාසයකින් සංදර්ශණය වේ. ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන මැජෙන්ටා වලින් පෙන්වා ඇත.TMEM95, IZUMO2 සහ IZUMO3 transmembrane helices නොපෙන්වයි.
IZUMO ප්‍රෝටීන් මෙන් නොව, අනෙකුත් SPACA ප්‍රෝටීන (එනම්, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 සහ SPACA9) SPACA6 ට වඩා ව්‍යුහාත්මකව වෙනස් යැයි සැලකේ (රූපය S12).SPACA9ට පමණක් 4HB ඇත, නමුත් එයට SPACA6 හා සමාන සමාන්තර-ප්‍රති-සමාන්තර දිශානතියක් හෝ එකම ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධනයක් තිබීම අපේක්ෂා නොකෙරේ.සමාන Ig වැනි වසමක් ඇත්තේ SPACA1ට පමණි.ඇල්ෆාෆෝල්ඩ් පුරෝකථනය කරන්නේ SPACA3, SPACA4 සහ SPACA5 SPACA6 ට වඩා සම්පූර්ණයෙන්ම වෙනස් ව්‍යුහයක් ඇති බවයි.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, SPACA4 සංසේචනය කිරීමේදී භූමිකාවක් ඉටු කරන බව දන්නා නමුත් SPACA6 ට වඩා වැඩි ප්‍රමාණයකට, ඒ වෙනුවට ශුක්‍රාණු සහ oocyte zona pellucida52 අතර අන්තර්ක්‍රියා සඳහා පහසුකම් සපයයි.
අපගේ AlphaFold සෙවුමට IZUMO1 සහ SPACA6 4HB, TMEM95 සඳහා තවත් ගැළපීමක් හමු විය.TMEM95, තනි ශුක්‍රාණු-විශේෂිත ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ප්‍රෝටීනයක්, 32,33 ක් ඉවත් කළ විට පිරිමි මීයන් වඳභාවයට පත් කරයි.TMEM95 නොමැති ශුක්‍රාණු වල සාමාන්‍ය රූප විද්‍යාව, චලිතය සහ Zona pellucida විනිවිද යාමට සහ බිත්තර පටලයට බැඳීමට හැකියාව තිබූ නමුත් oocyte membrane සමඟ ඒකාබද්ධ වීමට නොහැකි විය.පෙර අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ TMEM95 IZUMO133 සමඟ ව්‍යුහාත්මක සමානකම් බෙදා ගන්නා බවයි.ඇත්ත වශයෙන්ම, AlphaFold ආකෘතිය TMEM95 යනු IZUMO1 සහ SPACA6 ලෙස එකම CXXC මෝස්තර යුගලයක් සහිත 4HB සහ SPACA6 හි සොයාගත් හෙලිස් 1 සහ 2 අතර එම අතිරේක ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධනය බව තහවුරු කළේය (රූපය 3a සහ S11).TMEM95 හි Ig වැනි වසමක් නොමැති වුවද, එය SPACA6 සහ IZUMO1 hinge කලාපවලට සමාන ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන රටාවක් සහිත කලාපයක් ඇත (රූපය 3b).මෙම අත්පිටපත ප්‍රකාශයට පත් කරන අවස්ථාවේදී, පූර්ව මුද්‍රණ සේවාදායකය TMEM95 හි ව්‍යුහය වාර්තා කරන ලද අතර, AlphaFold53 ප්‍රතිඵලය තහවුරු කරන ලදී.TMEM95 SPACA6 සහ IZUMO1 ට බෙහෙවින් සමාන වන අතර දැනටමත් උභයජීවීන් තුළ පරිණාමීය ලෙස සංරක්ෂණය කර ඇත (රූපය 4 සහ S13).
PSI-BLAST සෙවුම NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, සහ SOF1 දත්ත සමුදායන් ජීවන වෘක්ෂය තුළ මෙම අනුපිළිවෙලෙහි පිහිටීම තීරණය කිරීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී.ශාඛා ලක්ෂ්‍ය අතර දුර පරිමාණයට නොපෙන්වයි.
SPACA6 සහ IZUMO1 අතර කැපී පෙනෙන සමස්ත ව්‍යුහාත්මක සමානතාවයෙන් ඇඟවෙන්නේ ඔවුන් TMEM95 සහ IZUMO 2, 3, සහ 4 ප්‍රෝටීන ඇතුළත් සංරක්‍ෂිත ව්‍යුහාත්මක සුපිරි පවුලක ආරම්භක සාමාජිකයන් බවයි.දන්නා සාමාජිකයන්: IZUMO1, SPACA6 සහ TMEM95.Ig වැනි වසම් ඇත්තේ සාමාජිකයින් කිහිප දෙනෙකුට පමණක් නිසා, IST superfamily හි ලක්ෂණය වන්නේ 4HB වසම වන අතර, මෙම ප්‍රෝටීන සියල්ලටම පොදු වූ සුවිශේෂී ලක්ෂණ ඇත: 1) සමාන්තරව/සමාන්තර විරෝධී ප්‍රත්‍යාවර්තයකින් සකස් කර ඇති හෙලිස් සහිත දඟර 4HB (රූපය . 5a), 2) මිටියේ ත්‍රිකෝණාකාර මුහුණක් ඇති අතර එය මිටිය තුළ ඇති හෙලික්ස් දෙකකින් සහ තුන්වන සිරස් හෙලික්ස් වලින් සමන්විත වේ (රූපය. ප්‍රධාන ප්‍රදේශය (රූපය 5c). තයෝරෙඩොක්සින් වැනි ප්‍රෝටීන වල ඇති CXXC මෝස්තරය ක්‍රියා කරන බව දන්නා කරුණකි. රෙඩොක්ස් සංවේදකයක් ලෙස 54,55,56 , IST පවුලේ සාමාජිකයින්ගේ මෝස්තරය ගැමේට් විලයනයේදී ERp57 වැනි ප්‍රෝටීන් ඩයිසල්ෆයිඩ් සමාවයවික සමග සම්බන්ධ කළ හැක.භූලිකාවන් 57,58 සම්බන්ධ වේ.
IST superfamily හි සාමාජිකයින් 4HB වසමෙහි ලාක්ෂණික ලක්ෂණ තුනකින් නිර්වචනය කර ඇත: සමාන්තර සහ ප්‍රති-සමාන්තර දිශානතිය අතර ප්‍රත්‍යාවර්ත වන හෙලික්ස් හතරක්, ba-ත්‍රිකෝණාකාර හෙලික්සීය මිටි මුහුණු සහ කුඩා අණු අතර සාදන ලද ca CXXC ද්විත්ව මෝස්තරයක්.) N-ටර්මිනල් හෙලික්ස් (තැඹිලි) සහ hinge කලාපය β-hairpin (කොළ).
SPACA6 සහ IZUMO1 අතර ඇති සමානත්වය අනුව, IZUMO1 හෝ JUNO වෙත බැඳීමේ හැකියාව පරීක්ෂා කරන ලදී.Biolayer interferometry (BLI) යනු IZUMO1 සහ JUNO අතර අන්තර්ක්‍රියා ප්‍රමාණ කිරීමට පෙර භාවිතා කරන ලද චාලක පාදක බන්ධන ක්‍රමයකි.JUNO විශ්ලේෂණවල ඉහළ සාන්ද්‍රණයක් සහිත ඇමක් ලෙස IZUMO1 සමඟ biotin-ලේබල් කරන ලද සංවේදකය පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමෙන් පසුව, ප්‍රබල සංඥාවක් අනාවරණය විය (Fig. S14a), සංවේදක තුඩයට අමුණා ඇති ජෛව ද්‍රව්‍යයේ thickness ණකමෙහි බන්ධන ප්‍රේරිත වෙනසක් පෙන්නුම් කරයි.සමාන සංඥා (එනම්, IZUMO1 විශ්ලේෂණයට එරෙහිව ඇමක් ලෙස සංවේදකයට JUNO සම්බන්ධ කර ඇත) (Fig. S14b).SPACA6 සංවේදක-බැඳුනු IZUMO1 හෝ සංවේදක-බන්ධිත JUNO වලට එරෙහිව විශ්ලේෂකයක් ලෙස භාවිතා කරන විට කිසිදු සංඥාවක් අනාවරණය නොවීය (Figure S14a,b).මෙම සංඥාව නොමැති වීමෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ SPACA6 හි බාහිර සෛල වසම IZUMO1 හෝ JUNO හි බාහිර සෛල වසම සමඟ අන්තර්ක්‍රියා නොකරන බවයි.
BLI විශ්ලේෂණය ඇමක් ප්‍රෝටීන් මත නිදහස් ලයිසීන් අපද්‍රව්‍යවල බයෝටයිනයිලීකරණය මත පදනම් වී ඇති නිසා, ලයිසීන් අපද්‍රව්‍ය අන්තර්ක්‍රියාවට සම්බන්ධ නම් මෙම වෙනස් කිරීම බන්ධනය වැළැක්විය හැකිය.මීට අමතරව, සංවේදකයට සාපේක්ෂව බන්ධනයේ දිශානතිය මගින් ස්ටෙරික් බාධා ඇති කළ හැක, එබැවින් ප්‍රතිසංයෝජක SPACA6, IZUMO1 සහ JUNO ectodomains මත ද සම්ප්‍රදායික පුල්-පහළ තක්සේරු කිරීම් සිදු කරන ලදී.එසේ තිබියදීත්, SPACA6 ඔහුගේ-ටැග් කළ IZUMO1 හෝ ඔහුගේ-ටැග් කළ JUNO (Fig. S14c,d) සමඟ අවක්ෂේප නොකළ අතර, BLI අත්හදා බැලීම් වලදී නිරීක්ෂණය කරන ලද අන්තර්ක්‍රියාවලට අනුකූල නොවන බව පෙන්නුම් කරයි.ධනාත්මක පාලනයක් ලෙස, අපි ඔහුගේ IZUMO1 (Figures S14e සහ S15) ලේබල් කර ඇති JUNO හි අන්තර්ක්‍රියා තහවුරු කළෙමු.
SPACA6 සහ IZUMO1 අතර ව්‍යුහාත්මක සමානකම් තිබියදීත්, SPACA6 හට JUNO බැඳීමට නොහැකි වීම පුදුමයක් නොවේ.මානව IZUMO1 මතුපිට ජූනෝ සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කරන අපද්‍රව්‍ය 20කට වැඩි ප්‍රමාණයක් ඇත, එක් එක් ප්‍රදේශ තුනෙන් අපද්‍රව්‍ය ඇතුළුව (ඒවායින් බොහොමයක් hinge කලාපයේ පිහිටා ඇතත්) (Fig. S14f).මෙම අපද්‍රව්‍ය වලින් එකක් පමණක් SPACA6 (Glu70) හි සංරක්ෂණය කර ඇත.බොහෝ අපද්‍රව්‍ය ප්‍රතිස්ථාපන ඒවායේ මුල් ජෛව රසායනික ගුණාංග රඳවා තබා ගත් අතර, IZUMO1 හි අත්‍යවශ්‍ය Arg160 අපද්‍රව්‍ය SPACA6 හි සෘණ ආරෝපිත Asp148 මගින් ප්‍රතිස්ථාපනය විය;පෙර අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ IZUMO1 හි Arg160Glu විකෘතිය JUNO43 සමඟ බැඳීම සම්පූර්ණයෙන්ම පාහේ අහෝසි කරන බවයි.මීට අමතරව, IZUMO1 සහ SPACA6 අතර වසම් දිශානතියේ වෙනස SPACA6 (Fig. S14g) හි සමාන කලාපයේ JUNO-බන්ධන අඩවියේ මතුපිට විශාලත්වය සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි කළේය.
ගැමේට් විලයන සඳහා SPACA6 සඳහා අවශ්‍යතාවය සහ IZUMO1 ට සමාන බව තිබියදීත්, SPACA6 ට සමාන ජූනෝ බන්ධන ශ්‍රිතයක් ඇති බවක් නොපෙනේ.එබැවින්, පරිණාමීය ජීව විද්‍යාව විසින් සපයන ලද වැදගත්කම පිළිබඳ සාක්ෂි සමඟ අපගේ ව්‍යුහාත්මක දත්ත ඒකාබද්ධ කිරීමට අපි උත්සාහ කළෙමු.SPACA6 සමජාතීය අනුක්‍රමික පෙළගැස්ම ක්ෂීරපායින්ගෙන් ඔබ්බට පොදු ව්‍යුහයේ සංරක්ෂණය පෙන්නුම් කරයි.නිදසුනක් වශයෙන්, දුරස්ථව සම්බන්ධ උභයජීවීන් තුළ පවා සිස්ටීන් අපද්‍රව්‍ය පවතී (රූපය 6a).ConSurf සේවාදායකය භාවිතා කරමින්, අනුක්‍රමික 66 ක බහු අනුක්‍රමික පෙළගැස්වීමේ රඳවා ගැනීමේ දත්ත SPACA6 මතුපිටට සිතියම් ගත කරන ලදී.මෙම ආකාරයේ විශ්ලේෂණ මගින් ප්‍රෝටීන් පරිණාමය තුළ සංරක්ෂණය කර ඇති අපද්‍රව්‍ය පෙන්විය හැකි අතර ක්‍රියාකාරීත්වයේ කාර්යභාරයක් ඉටු කරන්නේ කුමන මතුපිට කලාපද යන්න දැක්විය හැක.
CLUSTAL OMEGA භාවිතයෙන් සකස් කරන ලද විවිධ විශේෂ 12කින් SPACA6 ectodomains අනුක්‍රමික පෙළගැස්ම.ConSurf විශ්ලේෂණයට අනුව, වඩාත්ම ගතානුගතික ස්ථාන නිල් පැහැයෙන් සලකුණු කර ඇත.සිස්ටීන් අවශේෂ රතු පැහැයෙන් දක්වා ඇත.වසම් මායිම් සහ ද්විතියික ව්‍යුහ මූලද්‍රව්‍ය පෙළගැස්වීමේ මුදුනේ පෙන්වා ඇති අතර, ඊතල මගින් β-කෙඳි සහ තරංග මගින් හෙලික්ස් දක්වයි.අනුපිළිවෙල අඩංගු NCBI ප්‍රවේශ හඳුනාගැනීම් නම්: මානව (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), capuchin monkey (Cebus mimic, XP_017359300 caball),2 horse,2 Killer2060 caball le (Orcinus orca3_23 XP_032_034) .), බැටළුවන් (Ovis aries, XP_014955560), අලියා (Loxodonta africana, XP_010585293), බල්ලා (Canis lupus familyis, XP_025277208), මීයා (Mus musculus, NP_001156381), Tasharmancophianilus, 156381, XP_0318), ප්ලැටිපස්, 8) , 61_89 සහ Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).අංකනය මානව අනුපිළිවෙල මත පදනම් වේ.b ඉහළින් 4HB සහ පහළින් Ig වැනි වසම සහිත SPACA6 ව්‍යුහයේ මතුපිට නිරූපණය, ConSurf සේවාදායකයේ සංරක්ෂණ ඇස්තමේන්තු මත පදනම් වූ වර්ණ.හොඳම සංරක්ෂණය කර ඇති කොටස් නිල් පැහැයෙන් ද, මධ්‍යස්ථව සංරක්ෂණය කර ඇති කොටස් සුදු පැහැයෙන් ද, අවම වශයෙන් සංරක්ෂණය කර ඇත්තේ කහ පැහැයෙන් ද වේ.දම් පාට සිස්ටීන්.ඉහළ මට්ටමේ ආරක්ෂාවක් පෙන්නුම් කරන පෘෂ්ඨීය පැල්ලම් තුනක් 1, 2 සහ 3 ලෙස ලේබල් කරන ලද පැච් වල පෙන්වා ඇත. 4HB කාටූනයක් ඉහළ දකුණේ (එකම වර්ණ පටිපාටියක්) ඇතුල් කිරීමෙහි පෙන්වා ඇත.
SPACA6 ව්‍යුහය ඉතා සංරක්‍ෂිත මතුපිට කලාප තුනක් ඇත (රූපය 6b).Patch 1 හි 4HB සහ hinge කලාපය පුරා විහිදෙන අතර සංරක්‍ෂිත CXXC ඩයිසල්ෆයිඩ් පාලම් දෙකක්, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 hinge ජාලයක් (Fig. S7) සහ සංරක්‍ෂිත බාහිර ඇරෝමැටික අපද්‍රව්‍ය තුනක් (Phe31, Tyr73, Phe1373) අඩංගු වේ.ශුක්‍රාණු මතුපිට ධන ආරෝපිත අපද්‍රව්‍ය කිහිපයක් නියෝජනය කරන Ig වැනි වසමේ (Fig. S6e) පුළුල් දාරයක්.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, මෙම පැච් එකෙහි SPACA6 30 ක්‍රියාකාරීත්වයට බාධා කරන බව කලින් පෙන්වා දී ඇති ප්‍රතිදේහ එපිටොප් අඩංගු වේ.කලාපය 3 hinge සහ Ig වැනි වසමේ එක් පැත්තක් විහිදේ;මෙම කලාපයේ සංරක්‍ෂිත ප්‍රෝලීන් (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) සහ පිටතට මුහුණලා ඇති ධ්‍රැවීය/ආරෝපිත අපද්‍රව්‍ය අඩංගු වේ.පුදුමයට කරුණක් නම්, 4HB හි මතුපිට ඇති බොහෝ අපද්‍රව්‍ය ඉතා විචල්‍ය වේ (රූපය 6b), නමුත් SPACA6 සමලිංගික (හයිඩ්‍රොෆෝබික් බණ්ඩල් හරයේ ගතානුගතිකත්වය මගින් පෙන්නුම් කරන පරිදි) සහ IST සුපිරි පවුලෙන් ඔබ්බට නැමීම සංරක්ෂණය කර ඇත.
හඳුනාගත හැකි අඩුම ද්විතියික ව්‍යුහ මූලද්‍රව්‍ය සහිත SPACA6 හි කුඩාම කලාපය මෙය වුවද, බොහෝ hinge කලාප ශේෂයන් (කලාප 3 ඇතුළුව) SPACA6 සමජාතීයයන් අතර ඉතා ඉහළින් සංරක්ෂණය කර ඇත, එයින් ඇඟවෙන්නේ හෙලික්සීය බණ්ඩලය සහ β-සැන්ඩ්විච් වල දිශානතිය භූමිකාවක් ඉටු කරන බවයි.ගතානුගතික ලෙස.කෙසේ වෙතත්, SPACA6 සහ IZUMO1 හි hinge කලාපයේ පුළුල් හයිඩ්‍රජන් බන්ධන සහ විද්‍යුත් ස්ථිතික ජාල තිබියදීත්, IZUMO137,43,44 හි බහුවිධ අවසර ලත් ව්‍යුහයන් පෙළගැස්වීමේදී සහජ නම්‍යශීලී බව පිළිබඳ සාක්ෂි දැකිය හැකිය.තනි වසම්වල පෙළගැස්ම හොඳින් අතිච්ඡාදනය වී ඇත, නමුත් එකිනෙකට සාපේක්ෂව වසම්වල දිශානතිය මධ්යම අක්ෂයේ සිට 50 ° සිට 70 ° දක්වා වෙනස් විය (රූපය S16).විසඳුමේ SPACA6 හි අනුකූල ගතිකත්වය අවබෝධ කර ගැනීම සඳහා, SAXS අත්හදා බැලීම් සිදු කරන ලදී (Fig. S17a,b).SPACA6 ectodomain හි ආරම්භක ප්‍රතිනිර්මාණය රොඩ් ස්ඵටික ව්‍යුහයකට (පය. S18) අනුකූල විය, නමුත් Kratky කුමන්ත්‍රණය යම් තරමක නම්‍යශීලී බවක් පෙන්නුම් කරයි (Fig. S17b).මෙම අනුකූලතාව IZUMO1 සමඟ ප්‍රතිවිරුද්ධ වේ, එහි නොබැඳි ප්‍රෝටීන් දැලිස් සහ ද්‍රාවණය යන දෙකෙහිම බූමරන්ග් හැඩයක් ගනී.
නම්‍යශීලී කලාපය නිශ්චිතව හඳුනා ගැනීම සඳහා, හයිඩ්‍රජන්-ඩියුටීරියම් හුවමාරු ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (H-DXMS) SPACA6 මත සිදු කරන ලද අතර මීට පෙර IZUMO143 මත ලබාගත් දත්ත සමඟ සසඳන ලදී (රූපය 7a,b).SPACA6 පැහැදිලිවම IZUMO1 ට වඩා නම්‍යශීලී වන අතර, තත්පර 100,000 ක හුවමාරුවෙන් පසු ව්‍යුහය පුරා ඇති ඉහළ ඩියුටීරියම් හුවමාරුව මගින් සාක්ෂි දරයි.ව්‍යුහයන් දෙකෙහිම, hinge කලාපයේ C-පර්යන්ත කොටස ඉහළ මට්ටමේ හුවමාරුවක් පෙන්නුම් කරයි, සමහර විට 4HB සහ Ig වැනි වසම් එකිනෙකට සාපේක්ෂව සීමිත භ්‍රමණයකට ඉඩ සලසයි.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, 147CDLPLDCP154 අපද්‍රව්‍ය වලින් සමන්විත SPACA6 hinge හි C-පර්යන්ත කොටස ඉතා සංරක්‍ෂිත කලාපයක් 3 (රූපය 6b) වන අතර, එය අන්තර් වසම් නම්‍යශීලී බව SPACA6 හි පරිණාමීය ලෙස සංරක්‍ෂිත ලක්‍ෂණයක් බව පෙන්නුම් කරයි.නම්‍යශීලී විශ්ලේෂණයට අනුව, CD තාප දියවන දත්ත පෙන්නුම් කළේ SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (රූපය S1e සහ S19) ට වඩා අඩු ස්ථායී බවයි.
SPACA6 සහ b IZUMO1 හි H-DXMS රූප.ප්‍රතිශත ඩියුටීරියම් හුවමාරුව දක්වා ඇති කාල ස්ථානවල තීරණය කරන ලදී.හයිඩ්‍රජන්-ඩියුටීරියම් හුවමාරු මට්ටම් නිල් (10%) සිට රතු (90%) දක්වා ශ්‍රේණියේ පරිමාණයෙන් වර්ණයෙන් දැක්වේ.කළු පෙට්ටි ඉහළ හුවමාරු ප්රදේශ නියෝජනය කරයි.ස්ඵටික ව්‍යුහයේ නිරීක්ෂණය කරන ලද 4HB, hinge සහ Ig වැනි වසමෙහි මායිම් ප්‍රාථමික අනුපිළිවෙලට ඉහලින් පෙන්වා ඇත.10 s, 1000 s සහ 100,000 s හි ඩියුටීරියම් හුවමාරු මට්ටම් SPACA6 සහ IZUMO1 හි විනිවිද පෙනෙන අණුක පෘෂ්ඨ මත අධිස්ථාපනය කරන ලද තීරු සටහනක් මත සැලසුම් කර ඇත.50% ට අඩු ඩියුටීරියම් හුවමාරු මට්ටමක් සහිත ව්යුහයන්ගේ කොටස් සුදු පැහැයෙන් වර්ණාලේප කර ඇත.50% ට වැඩි H-DXMS හුවමාරු ප්‍රදේශ අනුක්‍රමණ පරිමාණයකින් වර්ණ ගැන්වේ.
CRISPR/Cas9 සහ මවුස් ජාන knockout ජාන උපාය මාර්ග භාවිතය ශුක්‍රාණු සහ ඩිම්බ බන්ධනය සහ විලයනය සඳහා වැදගත් සාධක කිහිපයක් හඳුනා ගැනීමට හේතු වී ඇත.IZUMO1-JUNO සහ CD9 ව්‍යුහයේ හොඳින් සංලක්ෂිත අන්තර්ක්‍රියා හැරුණු විට, ගැමේට් විලයනය හා සම්බන්ධ බොහෝ ප්‍රෝටීන ව්‍යුහාත්මකව සහ ක්‍රියාකාරීව ප්‍රහේලිකාව ලෙස පවතී.SPACA6 හි ජෛව භෞතික සහ ව්‍යුහාත්මක ගුනාංගීකරනය සංසේචනයේදී ඇති වන ඇලීම/විලයන අණුක ප්‍රහේලිකාවේ තවත් කොටසකි.
SPACA6 සහ IST සුපිරි පවුලේ අනෙකුත් සාමාජිකයන් ක්ෂීරපායීන් මෙන්ම තනි තනි පක්ෂීන්, උරගයින් සහ උභයජීවීන් තුළ ඉතා සංරක්ෂණය කර ඇති බව පෙනේ;ඇත්ත වශයෙන්ම, zebrafish 59 හි සංසේචනය සඳහා පවා SPACA6 අවශ්‍ය යැයි සිතේ. මෙම ව්‍යාප්තිය DCST134, DCST234, FIMP31 සහ SOF132 වැනි අනෙකුත් දන්නා ගැමට් විලයන ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන වලට සමාන වේ, මෙම සාධක HAP2-අඩුපාතික බව යෝජනා කරයි (එසේම GCS1 ලෙස හඳුන්වනු ලබන ප්‍රෝටීන බොහෝ ප්‍රෝටිස්ට් වල උත්ප්‍රේරක ක්‍රියාකාරකම් සඳහා වගකිව යුතු වේ., ශාක සහ ආත්‍රපෝඩාවන්.සංසේචනය කරන ලද විලයන ප්‍රෝටීන 60, 61. SPACA6 සහ IZUMO1 අතර ප්‍රබල ව්‍යුහාත්මක සමානකමක් තිබියදීත්, මෙම ප්‍රෝටීන දෙකෙන් එකක් කේතනය කරන ජානවල තට්ටු කිරීම පිරිමි මීයන්ගේ වඳභාවයට හේතු විය, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ ගැමේට් විලයනයෙහි ඒවායේ ක්‍රියාකාරිත්වය අනුපිටපත් නොවන බවයි..වඩාත් පුළුල් ලෙස, විලයනයේ ඇලවුම් අවධිය සඳහා අවශ්‍ය දන්නා ශුක්‍රාණු ප්‍රෝටීන කිසිවක් අතිරික්ත නොවේ.
SPACA6 (සහ IST superfamily හි අනෙකුත් සාමාජිකයින්) අන්තර් ක්‍රීඩා හන්දිවලට ​​සහභාගී වන්නේද, වැදගත් ප්‍රෝටීන විලයන ලක්ෂ්‍යවලට බඳවා ගැනීම සඳහා අභ්‍යන්තර ගැමිටික් ජාල සාදන්නේද, නැතහොත් සමහර විට නොපෙනෙන ෆියුසෝජන් ලෙස ක්‍රියා කරන්නේද යන්න විවෘත ප්‍රශ්නයකි.HEK293T සෛලවල සම-ප්‍රතිශක්තිකරණ අධ්‍යයනයන් මගින් සම්පූර්ණ දිග IZUMO1 සහ SPACA632 අතර අන්තර්ක්‍රියාවක් අනාවරණය විය.කෙසේ වෙතත්, අපගේ recombinant ectodomains vitro හි අන්තර්ක්‍රියා නොකළ අතර, Noda et al හි දක්නට ලැබෙන අන්තර්ක්‍රියා යෝජනා කරයි.ගොඩනැගීමේදී දෙකම මකා දමන ලදී (IZUMO1 හි සයිටොප්ලාස්මික් වලිගය සැලකිල්ලට ගන්න, එය සංසේචනය සඳහා අනවශ්‍ය බව පෙන්වා දී ඇත62).විකල්පයක් ලෙස, IZUMO1 සහ/හෝ SPACA6 සඳහා භෞතික විද්‍යාත්මකව නිශ්චිත අනුකූලතා හෝ වෙනත් ප්‍රෝටීන අඩංගු අණුක සංකීර්ණ වැනි vitro තුළ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය නොකරන විශේෂිත බන්ධන පරිසරයන් අවශ්‍ය විය හැකිය (දන්නා හෝ තවමත් සොයාගෙන නොමැත).IZUMO1 ectodomain perivitelline අවකාශයේ බිත්තරයට spermatozoa සම්බන්ධ කිරීම මැදිහත් වන බව විශ්වාස කළද, SPACA6 ectodomain හි අරමුණ පැහැදිලි නැත.
SPACA6 හි ව්‍යුහය ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියාවලට සම්බන්ධ විය හැකි සංරක්‍ෂිත මතුපිට කිහිපයක් හෙළි කරයි.CXXC මෝස්තරයට (ඉහත නම් කර ඇති Patch 1) වහාම යාබදව ඇති hinge කලාපයේ සංරක්‍ෂිත කොටසෙහි බාහිරට මුහුණලා ඇති ඇරෝමැටික අපද්‍රව්‍ය කිහිපයක් ඇති අතර ඒවා බොහෝ විට ජෛව අණු අතර ජලභීතික සහ π-ස්ටැකිං අන්තර්ක්‍රියා සමඟ සම්බන්ධ වේ.Ig-සමාන වසමේ පුළුල් පැති (කලාපය 2) ඉහළ සංරක්‍ෂිත Arg සහ ඔහුගේ අපද්‍රව්‍ය සහිත ධන ආරෝපිත වලක් සාදයි, සහ මෙම කලාපයට එරෙහි ප්‍රතිදේහ මීට පෙර gamete fusion 30 අවහිර කිරීමට භාවිතා කර ඇත.ප්‍රතිදේහය 212RIRPAQLTHRGTFS225 රේඛීය එපිටොප් හඳුනා ගනී, එහි ආර්ජිනීන් අවශේෂ හයෙන් තුනක් සහ ඉහළ සංරක්‍ෂිත His220 ඇත.අක්රිය වීම මෙම විශේෂිත අවශේෂයන් හෝ සමස්ත කලාපයම අවහිර වීම නිසාද යන්න පැහැදිලි නැත.β-සැන්ඩ්විච් හි C-පර්යන්තය අසල මෙම පරතරය පිහිටීම අසල්වැසි ශුක්‍රාණු ප්‍රෝටීන සමඟ සිස් අන්තර්ක්‍රියා පෙන්නුම් කරයි, නමුත් ඕසයිට් ප්‍රෝටීන සමඟ නොවේ.තවද, hinge තුළ ඉතා නම්‍යශීලී ප්‍රෝලීන් පොහොසත් පටලැවිල්ලක් (අඩවිය 3) රඳවා තබා ගැනීම ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා අඩවියක් විය හැකිය, නැතහොත්, බොහෝ දුරට, වසම් දෙක අතර නම්‍යශීලීභාවය රඳවා තබා ගැනීම පෙන්නුම් කරයි.SPACA6 හි නොදන්නා භූමිකාව සඳහා ස්ත්‍රී පුරුෂ භාවය වැදගත් වේ.ගැමට් වල විලයනය.
SPACA6 හි Ig වැනි β-සැන්ඩ්විච් ඇතුළු අන්තර් සෛලීය ඇලවුම් ප්‍රෝටීන වල ගුණ ඇත.බොහෝ ඇලවුම් ප්‍රෝටීන (උදා, කැදරින්, ඉන්ටග්‍රීන්, ඇඩෙසින්, සහ IZUMO1) සෛල පටලයේ සිට පාරිසරික ඉලක්ක වෙත ප්‍රෝටීන දිගු කරන β-සැන්ඩ්විච් වසම් එකක් හෝ කිහිපයක් ඇත.SPACA6 හි Ig-සමාන වසමෙහි β-සැන්ඩ්විච් වල ඇලෙනසුලු සහ එකමුතුවේ බහුලව දක්නට ලැබෙන මෝස්තරයක් ද අඩංගු වේ: β-සැන්ඩ්විච්වල කෙළවරේ ඇති සමාන්තර කෙඳිවල ද්විත්ව, යාන්ත්‍රික කලම්ප ලෙස හැඳින්වේ.අන්තර් සෛලීය අන්තර්ක්‍රියාවලට සම්බන්ධ ප්‍රෝටීන සඳහා වටිනා මෙම මෝස්තරය කැපුම් බලවේගවලට ප්‍රතිරෝධය වැඩි කරන බව විශ්වාස කෙරේ.කෙසේ වෙතත්, adhesins වලට මෙම සමානකම තිබියදීත්, SPACA6 බිත්තර සුදු ජාතිකයින් සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බවට දැනට කිසිදු සාක්ෂියක් නොමැත.SPACA6 ectodomain හට JUNO හා බැඳීමට නොහැකි වන අතර SPACA6-ප්‍රකාශිත HEK293T සෛල, මෙහි පෙන්වා ඇති පරිදි, zona 32 නොමැති oocytes සමඟ කිසිසේත් අන්තර්ක්‍රියා නොකරයි.SPACA6 අන්තර් ලිංගික බන්ධන ඇති කරන්නේ නම්, මෙම අන්තර්ක්‍රියා සඳහා පශ්චාත් පරිවර්තන වෙනස් කිරීම් අවශ්‍ය විය හැකිය, නැතහොත් වෙනත් ශුක්‍රාණු ප්‍රෝටීන මගින් ස්ථායී වේ.අවසාන උපකල්පනයට සහය දැක්වීමක් ලෙස, IZUMO1-අඩුපාඩු සහිත ශුක්‍රාණු ඔයිසයිට් වලට බන්ධනය වන අතර, IZUMO1 හැර අනෙකුත් අණු ගැමෙට් ඇලවුම් පියවර 27 ට සම්බන්ධ බව පෙන්නුම් කරයි.
බොහෝ වෛරස්, සෛලීය සහ සංවර්ධන විලයන ප්‍රෝටීන වල ෆියුසෝජන් ලෙස ක්‍රියා කරන බව පුරෝකථනය කරන ගුණ ඇත.උදාහරණයක් ලෙස, වෛරස් විලයන glycoproteins (පංති I, II සහ III) ධාරක පටලයට ඇතුල් කරන ප්‍රෝටීන් අවසානයේ ජලභීතික විලයන පෙප්ටයිඩයක් හෝ ලූපයක් ඇත.IZUMO143 හි හයිඩ්‍රොෆිලිසිටි සිතියම සහ IST සුපිරි පවුලෙහි ව්‍යුහය (නිශ්චිත සහ පුරෝකථනය කරන ලද) කිසිදු පැහැදිලි ජලභීතික විලයන පෙප්ටයිඩයක් නොපෙන්වයි.මේ අනුව, IST superfamily හි කිසියම් ප්‍රෝටීනයක් ෆියුසෝජන් ලෙස ක්‍රියා කරන්නේ නම්, ඒවා වෙනත් දන්නා උදාහරණවලට වඩා වෙනස් ආකාරයකට ක්‍රියා කරයි.
අවසාන වශයෙන්, ගැමෙට් විලයනය හා සම්බන්ධ ප්‍රෝටීන වල IST සුපිරි පවුලෙහි සාමාජිකයින්ගේ ක්‍රියාකාරකම් සිත් ඇදගන්නා අභිරහසක් ලෙස පවතී.අපගේ සංලක්ෂිත SPACA6 ප්‍රතිසංයෝජන අණුව සහ එහි විසඳන ලද ව්‍යුහය මෙම හවුල් ව්‍යුහයන් අතර සම්බන්ධතා සහ ගැමේට් ඇමිණීම සහ විලයනය තුළ ඒවායේ භූමිකාව පිළිබඳ අවබෝධයක් ලබා දෙනු ඇත.
පුරෝකථනය කරන ලද මානව SPACA6 ectodomain (NCBI ප්‍රවේශ අංකය NP_001303901.1; අවශේෂ 27-246) ට අනුරූප DNA අනුක්‍රමය Drosophila melanogaster S2 සෛලවල ප්‍රකාශනය සඳහා කෝඩෝන-ප්‍රශස්ත කර ඇති අතර අනුක්‍රමය (Encoding of Geurzaks) සමඟ ජාන කැබැල්ලක් ලෙස සංස්ලේෂණය කරන ලදී., puromycin (pMT-puro) සමඟ තෝරා ගැනීම සඳහා වෙනස් කරන ලද metallothionein ප්‍රවර්ධකයක් මත පදනම් වූ pMT ප්‍රකාශන දෛශිකයක් බවට මෙම ජානයේ බන්ධන-ස්වාධීන ක්ලෝන කිරීම සඳහා BiP ස්‍රාවය සංඥා සහ අනුරූප 5′ සහ 3′ අවසන් වේ.pMT-puro දෛශිකය 10x-His C-terminal tag (Figure S2) මගින් thrombin cleavage site සංකේතනය කරයි.
SPACA6 pMT-puro දෛශිකය D. melanogaster S2 (Gibco) සෛල වෙත ස්ථායීව මාරු කිරීම IZUMO1 සහ JUNO43 සඳහා භාවිතා කරන ලද ප්‍රොටෝකෝලය හා සමානව සිදු කරන ලදී.S2 සෛල දිය වී ෂ්නයිඩර්ගේ මාධ්‍යයේ (ගිබ්කෝ) 10% (v/v) තාප අක්‍රිය කළල පැටවුන්ගේ මස්තු (ගිබ්කෝ) සහ 1X ප්‍රතිමිති නාශක ප්‍රතිජීවක (ගිබ්කෝ) අවසාන සාන්ද්‍රණය සමඟ පරිපූරණය කරන ලදී.මුල් ඡේද සෛල (3.0 x 106 සෛල) ළිං තහඩු 6 ක තනි ළිංවල (කෝනිං) ආලේප කර ඇත.27 ° C දී පැය 24 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමෙන් පසුව, නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලය අනුව SPACA6 pMT-puro දෛශිකයේ සහ Effectene transfection reagent (Qiagen) මිලිග්‍රෑම් 2 ක මිශ්‍රණයකින් සෛල මාරු කරන ලදී.මාරු කරන ලද සෛල පැය 72 ක් සඳහා පුර්වීකරණය කර පසුව 6 mg/ml puromycin සමඟ නෙලා ගන්නා ලදී.පසුව සෛල සම්පූර්ණ ෂ්නයිඩර්ගේ මාධ්‍යයෙන් හුදකලා කර මහා පරිමාණ ප්‍රෝටීන් නිෂ්පාදනය සඳහා මස්තු රහිත කෘමි-XPRESS මාධ්‍යයේ (Lonza) තැන්පත් කරන ලදී.S2 සෛල සංස්කෘතියේ 1 L කාණ්ඩයක් 2 L වාතාශ්‍රය සහිත පැතලි-පහළ පොලිප්‍රොපිලීන් Erlenmeyer ප්ලාස්ක් එකක සෛල 8-10 × 106 ml-1 දක්වා වර්ධනය කර පසුව 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) අවසාන සාන්ද්‍රණයෙන් විෂබීජහරණය කර පෙරීම සිදු කරන ලදී.ප්රේරිත.ප්‍රේරිත සංස්කෘතීන් දින හතරක් සඳහා 120 rpm ට 27 ° C. ට ඉන්කිබියුට් කරන ලදී.
10 kDa MWCO පටලයක් සහිත Centramate ස්පර්ශක ප්‍රවාහ පෙරීමේ පද්ධතියක් (Pall Corp) මගින් SPACA6 අඩංගු සමීකරණය කරන ලද මාධ්‍යය 4 ° C දී 5660×g දී කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීම මගින් හුදකලා කරන ලදී.SPACA6 අඩංගු සාන්ද්‍රිත මාධ්‍ය 2 ml Ni-NTA agarose දුම්මල (Qiagen) තීරුවකට යොදන්න.Ni-NTA ෙරසින් බෆර A හි තීරු වෙළුම් 10කින් (CV) සෝදා පසුව 50 mM හි අවසාන imidazole සාන්ද්‍රණය ලබා දීම සඳහා බෆර A CV 1ක් එකතු කරන ලදී.SPACA6 මිලිලීටර් 10ක බෆර A සමඟ ඉමිඩසෝල් සමඟ අතිරේකව 500 mM අවසාන සාන්ද්‍රණයක් දක්වා ඉවත් කරන ලදී.සීමා කිරීමේ පන්තියේ thrombin (Millipore Sigma) සෘජුවම ඩයලිසිස් නලයට (MWCO 12-14 kDa) SPACA6 මිලිග්‍රෑම් එකකට ඒකක 1 බැගින් එදිරිව 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 සහ 150 mM NaCl (බෆර් B) සඳහා එකතු කරන ලදී.) 4 ° C දී පැය 48 ක්.thrombin-cleaved SPACA6 පසුව ලුණු සාන්ද්‍රණය අඩු කිරීම සඳහා තුන් ගුණයකින් තනුක කර 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 සමඟ සමතුලිත 1 ml MonoS 5/50 GL කැටායන හුවමාරු තීරුවකට (Cytiva/GE) පටවන ලදී.කැටායන හුවමාරුකාරකය 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 කින් සෝදා ඇත, පසුව SPACA6 0 සිට 500 mM NaCl දක්වා රේඛීය අනුක්‍රමණයකින් 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 සඳහා 25 CV කින් ඉවත් කරන ලදී.අයන හුවමාරු වර්ණදේහ විද්‍යාවෙන් පසුව, SPACA6 මිලිලීටර 1කට සාන්ද්‍රණය කර ENrich SEC650 10 x 300 තීරුවකින් (BioRad) සමමුහුර්ත කරන ලදී B. වර්ණදේහයට අනුව, SPACA6 අඩංගු සංචිතය සහ සාන්ද්‍රණය භාග.16% SDS-polyacrylamide ජෙල් මත Coomassie-stained electrophoresis මගින් සංශුද්ධතාවය පාලනය කරන ලදී.ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණය බියර්-ලැම්බට් නියමය සහ න්‍යායික මවුල වඳවීමේ සංගුණකය භාවිතයෙන් 280 nm හි අවශෝෂණය මගින් ප්‍රමාණනය කරන ලදී.
පිරිපහදු කළ SPACA6 එක රැයකින් 10 mM සෝඩියම් පොස්පේට්, pH 7.4 සහ 150 mM NaF වලට එරෙහිව ඩයල් කරන ලද අතර CD වර්ණාවලීක්ෂය මගින් විශ්ලේෂණය කිරීමට පෙර 0.16 mg/mL දක්වා තනුක කර ඇත.185 සිට 260 nm දක්වා තරංග ආයාමයක් සහිත සංයුක්ත තැටිවල වර්ණාවලි පරිලෝකනය Jasco J-1500 වර්ණාවලීක්ෂයක් මත 1 mm දෘශ්‍ය මාර්ග දිග (Helma) සමඟ 25 ° C දී 50 nm/min අනුපාතයකින් ක්වාර්ට්ස් කුවෙට් භාවිතා කර එකතු කරන ලදී.CD වර්ණාවලි මූලික නිවැරදි කර, සාමාන්‍ය අත්පත් කර ගැනීම් 10කට වඩා වැඩි කර, සහ cm2/dmol අංශක වලින් අවශේෂ ඉලිප්සාකාරය (θMRE) බවට පරිවර්තනය කරන ලදී:
මෙහි MW යනු Da හි එක් එක් සාම්පලයේ අණුක බරයි;N යනු ඇමයිනෝ අම්ල ගණනයි;θ යනු මිලි අංශක වල ඉලිප්සාකාරය;d ප්‍රකාශ මාර්ගයේ දිගට සෙ.මී.ඒකකවල ප්රෝටීන් සාන්ද්රණය.