310 10*1mm මල නොබැඳෙන වානේ දඟර නල රසායනික සංරචකය, spidroin හි N-පර්යන්ත වසම් ඇමයිලොයිඩ් ෆයිබ්‍රිල් මත පදනම් වූ හයිඩ්‍රොජෙල් සාදන අතර ප්‍රෝටීන් නිශ්චලනය සඳහා වේදිකාවක් සපයයි.

Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ සීමිත CSS සහය ඇති බ්‍රවුසර අනුවාදයක් භාවිතා කරයි.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන කළ බ්‍රවුසරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා ප්‍රකාරය අක්‍රිය කරන්න).ඊට අමතරව, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාසිතා සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය පෙන්වමු.
එක් ස්ලයිඩයකට ලිපි තුනක් පෙන්වන ස්ලයිඩර්.ස්ලයිඩ හරහා ගමන් කිරීමට පසුපස සහ ඊළඟ බොත්තම් භාවිතා කරන්න, එක් එක් විනිවිදක හරහා ගමන් කිරීමට අවසානයේ ඇති ස්ලයිඩ පාලක බොත්තම් භාවිතා කරන්න.

පිරිවිතර

310 10*1mm මල නොබැඳෙන වානේ දඟර නල සැපයුම්කරුවන්

රසායනික සංයුතිය

යාන්ත්රික ගුණ

ප්‍රතිසංයෝජක මකුළු සේද ප්‍රෝටීන (මකුළු සේද ප්‍රෝටීන) නව ජෛව ද්‍රව්‍ය සංවර්ධනය කිරීමේදී බොහෝ විභව යෙදුම් ඇත, නමුත් ඒවායේ බහුමාධ්‍ය සහ සමුච්චයට නැඹුරු ස්වභාවය නිසා ඒවා ලබා ගැනීමට අපහසු වන අතර භාවිතයට පහසු වේ.මෙහිදී අපි වාර්තා කරන්නේ ප්‍රතිසංයෝජක කුඩා ස්පීඩ්‍රොයින් ප්‍රෝටීන සහ, වැදගත් ලෙස, N-පර්යන්ත වසම (NT) 37 °C දී ස්වයං-ආධාරක සහ විනිවිද පෙනෙන හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදෙන බවයි.NT සහ හරිත ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන් හෝ purine nucleoside phosphorylase වලින් සමන්විත විලයන ප්‍රෝටීන සම්පූර්ණ ක්‍රියාකාරී විලයන ප්‍රෝටීන සාදයි.හයිඩ්රොජල්.අපගේ ප්‍රතිඵල පෙන්නුම් කරන්නේ ප්‍රතිසංයෝජක NT සහ විලයන ප්‍රෝටීන මගින් ඉහළ ප්‍රකාශන අස්වැන්නක් ලබා දෙන අතර පාරදෘශ්‍යභාවය, හරස් සම්බන්ධ කිරීමකින් තොරව ජෙලේෂන් කිරීම සහ ඉහළ ඝනත්වයකින් ක්‍රියාකාරී ප්‍රෝටීන සෘජුව නිශ්චල කිරීම වැනි ආකර්ෂණීය ගුණාංග සහිත හයිඩ්‍රොජෙල් ලබා දෙන බවයි.
මකුළුවන්ට විවිධ සේද ග්‍රන්ථි හතක් පමණ ඇති අතර, ඒ සෑම එකක්ම නිශ්චිත සේද වර්ගයක් නිපදවයි.සේද විශේෂ හතම මකුළු සේද ප්‍රෝටීන (spidroins) 6000 ක පමණ දිගකින් සමන්විත වන අතර ගෝලාකාර N- සහ C-පර්යන්ත වසම් (NT සහ CT) 1,2 මගින් වට වූ විශාල මධ්‍යම පුනරාවර්තන කලාපයක් අඩංගු වේ.වඩාත් පුළුල් ලෙස අධ්‍යයනය කරන ලද සේද වර්ගය වන ප්‍රාථමික ඇම්පුල්ලා නිෂ්පාදනය කරනු ලබන්නේ ප්‍රාථමික ඇම්පුලා ග්‍රන්ථිය මගිනි.මෙම ග්‍රන්ථිය තුළ, අපිච්ඡද සෛලවල ඒක ස්තරයක් ස්පිඩ්‍රොයින් ප්‍රෝටීන සංස්ලේෂණය කර ග්‍රන්ථියේ ලුමෙන් වෙත ස්‍රාවය කරයි, එහිදී ඒවා අතිශයින් ඉහළ සාන්ද්‍රණයකින් (30-50% w/v) 3,4 ද්‍රාව්‍ය ආකාරයෙන් (ඩොපිං) පවතී.ග්‍රන්ථියේ ඇති ප්‍රධාන ඇම්පියුලර් ස්පීඩ්‍රොයින් ප්‍රෝටීන වල සංවිධානය සහ අනුකූලතාව විවාදයට ලක්ව ඇත, නමුත් බොහෝ පර්යේෂණාත්මක සාක්ෂි වලින් පෙන්නුම් කරන්නේ සාමාන්‍යයෙන් හෙලික්සීය සහ/හෝ අහඹු හෙලික්සීය අනුකූලතාවයක් සහ මයිකල් හෝ ලැමිලර් ව්‍යුහයන් 5,6,7,8,9,10 පවතින බවයි.පුනරාවර්තන වසම් සිල්ක් තන්තු වල යාන්ත්‍රික ගුණ නියාමනය කරන අතර, β-ෂීට් නැනෝ ස්ඵටික සහ අස්ඵටික ව්‍යුහයන් 11,12,13,14,15 සාදයි, අවසාන වසම් සිල්ක් ග්‍රන්ථිය දිගේ වෙනස්වන තත්වයන්ට ප්‍රතිචාර වශයෙන් සේද තන්තු නියාමනය කරයි.සේද සෑදීම පාලනය කිරීම මගින්, 19. පර්යන්ත වසම් පරිණාමීය ලෙස සංරක්ෂණය කර ඇති අතර ඒවායේ ක්‍රියාකාරිත්වය සියලුම spidroin ප්‍රෝටීන 2,20,21 සඳහා පොදු විය හැක.ග්‍රන්ථිය හරහා ගමන් කිරීමේදී, ස්පීඩ්‍රොයින් වල pH අගය 7.6 සිට <5.716 දක්වා අඩු වන අතර, ක්‍රමයෙන් පටු වන නාලිකාව හරහා චලනය වන විට කැපීම සහ දිග හැරීම සමඟ වැඩි වේ.ද්‍රාවණයේදී, CT යනු α-helical constitutive parallel dimer17, නමුත් අඩු pH අගය සහ කැපුම් බලවලට ප්‍රතිචාර වශයෙන්, CT දිගහැර β-layers16, 17 ස්විචය කරයි, සමහර විට Convert 16 හි පුනරාවර්තන කලාපවල β-ස්ථර ප්‍රේරණය කරයි. NT යනු monomeric යටතේ වේ. ග්‍රන්ථියේ ලුමෙන් තත්ත්වයන් පිළිබිඹු කරන තත්ත්වයන් සහ ස්පීඩ්‍රොයින් ද්‍රාව්‍යතාවයට මැදිහත් වේ, නමුත් pH අගය අඩු වූ විට, කාබොක්සිලික් අම්ල පැති දාම ගණනාවක් ප්‍රෝටෝනය කිරීම ආසන්න වශයෙන් 6.5 pKa සමඟ NT ඩයිමර්කරණයට මග පාදයි. ප්රමාණ.ජාල16,18.මේ අනුව, NT සූතිකා සෑදීමේදී ප්‍රධාන කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි, ආලේපනයේ මොනෝමරයක සිට ෆයිබර්23,24,25 හි ඩයිමර් දක්වා වෙනස් වේ.NT 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 දක්වා අධ්‍යයනය කරන ලද සියලුම තත්ත්‍වයන් යටතේ ඉතා ද්‍රාව්‍ය සහ සර්පිලාකාරව පවතී, එය විෂම ප්‍රෝටීන නිෂ්පාදනය සඳහා ද්‍රාව්‍යතාව වැඩි කරන ලේබලයක් ලෙස එහි වර්ධනයට අනුබල දුන්නේය.
එක් NT, එක් කෙටි පුනරාවර්තන කලාපයක්, එක් CT සහ පිරිසිදු කිරීම සඳහා His6 ටැගය (His-NT2RepCT) වලින් සමන්විත Recombinant mini spider silk protein, දේශීය මකුළු සේද ප්‍රෝටීන් මෙන් ජලීය බෆරයේ ද්‍රාව්‍ය වන අතර සේද මකුළුවාගේ දේශීය වැදගත් ලක්ෂණ අනුකරණය කරයි. .ආවරණය 25.31.ඔහුගේ-NT2RepCT pH 8 ද්‍රාව්‍ය ආලේපනයක් pH 525,32,33,34,35 ජල ස්නානයකට නෙරා ඇති ජෛවමිතික යන්ත්‍රයක් භාවිතයෙන් අඛණ්ඩ තන්තු වලට කරකැවිය හැක.E. coli හි ජෛව ප්‍රතික්‍රියාකාරක පැසවීම ඔහුගේ-NT2RepCT ප්‍රකාශ කිරීම සහ පසු ප්‍රතිකාරයේ ප්‍රතිඵලයක් ලෙස පිරිසිදු කිරීමෙන් පසු >14 g/L අස්වැන්නක් ලැබිණි.ආම්ලික තත්ත්‍වයට His-NT2RepCT හි ඉහළ අස්වැන්න, ඉහළ ද්‍රාව්‍යතාව සහ ප්‍රමාණවත් ප්‍රතිචාරය යන සියල්ල NT23, 25, 34 වෙත ආරෝපණය කර ඇත.
37 °C දී ප්‍රෝටීන් ද්‍රාවණයක් පුර්වකාශනය කිරීමෙන් NT පමණක් ඇතුළුව ප්‍රතිසංයෝජක ස්පයිඩ්‍රොයින් ප්‍රෝටීන වලින් විනිවිද පෙනෙන හයිඩ්‍රොජෙල් වේගයෙන් ගොඩනැගීම මෙහිදී අපි වාර්තා කරමු.thioflavin T fluorescence (ThT), ෆූරියර් පරිවර්තන අධෝරක්ත වර්ණාවලීක්ෂය (FTIR), න්‍යෂ්ටික චුම්භක අනුනාද වර්ණාවලීක්ෂය (NMR) සහ සම්ප්‍රේෂණ ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂය (TEM) භාවිතා කරමින්, NT සහ microspider ප්‍රෝටීන ව්‍යුහාත්මක ලෙස β-like fibrils සහ amylls-sheets බවට පරිවර්තනය වන බව අපි සොයා ගත්තෙමු. ජෙල් සෑදූ විට.ඊට අමතරව, NT සහ හරිත ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන් (GFP) හෝ පියුරීන් නියුක්ලියෝසයිඩ් පොස්පරිලේස් (PNP) හි විලයන ප්‍රෝටීන පූර්ණ ක්‍රියාකාරී විලයන කොටස් සහිත හයිඩ්‍රොජෙල් සාදයි.භෞතික විද්‍යාත්මක තත්ත්‍වයන් යටතේ හයිඩ්‍රොජෙල් ශීඝ්‍ර ගොඩනැගීමත් සමඟ විෂම ධාරකවල ඉහළ-නිලධාරී ප්‍රකාශනය, ඉංජිනේරුමය ක්‍රියාකාරකම් සහිත හයිඩ්‍රොජෙල්වල ලාභදායී නිෂ්පාදනයේ හැකියාව විවෘත කරයි.
බොහෝ වාර්තාගත ප්‍රතිසංයෝජක ස්පීඩ්‍රොයින් ප්‍රෝටීන මෙන් නොව, His-NT2RepCT pH 8 හි Tris-HCl බෆරයේ ස්ථායී වන අතර වර්ෂාපතනයකින් තොරව 500 mg/mL දක්වා සාන්ද්‍රණය කළ හැක25.එමනිසා, මෙම ප්‍රෝටීනය 37°C (පය. 1b-d) දී පුර්වීකරණය කළ විට දෘශ්‍යමය වශයෙන් පැහැදිලි, ස්වයං ආධාරක හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදෙන බව දැකීමෙන් අපි පුදුමයට පත් විය.වැඩිදුර අධ්‍යයනවලින් පෙන්නුම් කළේ ඔහුගේ-NT2RepCT gelation පුළුල් පරාසයක ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණයන් (10-300 mg/mL) හරහා සිදු වූ අතර මෙම සාන්ද්‍රණය ජෙලේෂන් කාලය සමඟ ප්‍රතිලෝමව සහසම්බන්ධ වී ඇති බවයි (රූපය 1c සහ පරිපූරක Fig. 1).His-NT2RepCT හි හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදීමට මැදිහත් වන්නේ කුමන කොටස්ද යන්න සොයා බැලීම සඳහා, අපි එක් එක් වසම තනි තනිව සහ විවිධ සංයෝජන මගින් ප්ලාස්ක් ප්‍රතිලෝම තක්සේරුවක් භාවිතා කර පරීක්ෂා කළෙමු (රූපය 1a,b).අවක්ෂේපිත 2Rep (පය. 1b) හැර, ප්‍රතිසංයෝජක ස්පීඩ්‍රොයින් හි සියලුම පරීක්‍ෂා කරන ලද කොටස් පැය 1 ට අඩු කාලයකදී ජෙල් (ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණය 300 mg/mL දී) සාදන ලදී.මෙයින් ඇඟවෙන්නේ NT සහ CT පමණක්, සංයෝජනයෙන් හෝ පුනරාවර්තන සමඟ සම්බන්ධව, 37 ° C දී ජෙල් කළ හැකි බවත් His6 ටැගය මෙම ක්‍රියාවලියට සැලකිය යුතු ප්‍රමාණයකට බලපාන්නේ නැති බවත් ය.NT යනු ඉතා ද්‍රාව්‍ය සහ ස්ථායී ප්‍රෝටීනයක් වන අතර, ප්‍රතිසංයෝජක ස්පිඩ්‍රොයින් හයිඩ්‍රොජෙල් පිළිබඳ පූර්ව වාර්තා පුනරාවර්තන කලාපවල සහ/හෝ CT වල අනුරූප වෙනස්වීම් වලට ජෙලේෂන් බලපෑම් ආරෝපණය කර ඇති බව පොදු මතය අනුව, NT විසින්ම කළ හැකිය.ජෙලේෂන් සොයා ගැනීම අනපේක්ෂිත විය.පරිපූරක වගුව 1) 37, 38, 39. කැපී පෙනෙන ලෙස, NT දැනටමත් ≥ 300 mg/mL සාන්ද්‍රණයකින් මිනිත්තු 10 ක් ඇතුළත ජෙල් කර ඇත (රූපය 1c).NT හි විවිධ සාන්ද්‍රණයන් සහිත කුප්පි ප්‍රතිලෝම අත්හදා බැලීම්වලින් පෙන්නුම් කළේ > 50 mg/mL හි NT ද්‍රාවණය ඔහුගේ-NT2RepCT ට වඩා වේගයෙන් අනුරූප සාන්ද්‍රණයේදී ජෙල් කරන ලද බවයි (w/v, Figure 1c).
මෙම කාර්යයේ අධ්‍යයනය කරන ලද විවිධ ස්පයිඩ්‍රොයින් ඉදිකිරීම් වල ක්‍රමානුකූල නිරූපණය.b විවිධ ප්‍රතිසංයෝජක ස්පයිඩ්‍රොයින් ප්‍රෝටීන (300 mg/mL) සඳහා 37 °C දී ජෙල් කාලය කුප්පිය පෙරළීම මගින් තහවුරු කර ඇත.CT ජෙල් ඉන්කියුබේෂන් නොමැතිව වහාම (<300 mg/mL), 2Rep අවක්ෂේප (300 mg/mL, 5 mm පරිමාණය).c His-NT2RepCT සහ NT වල ජෙල් කාලය 37°C දී පෙන්නුම් කරන ලද ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණයන්හි.d මකුළුවා සහිත His-NT2RepCT සහ NT හයිඩ්‍රොජෙල්වල ඡායාරූප සහ “NT” අකුර පිළිවෙලින් යටින් මුද්‍රණය කර ඇත (දෙකම 200 mg/mL, පරිමාණ තීරුව 5 mm).
විවිධ ප්‍රතිසංයෝජක ස්පීඩ්‍රොයින් ප්‍රෝටීන මගින් සාදනු ලබන හයිඩ්‍රොජෙල් තරමක් වෙනස් වර්ණ ඇති අතර පියවි ඇසින් නිරීක්ෂණය කිරීමේදී විවිධ මට්ටමේ විනිවිදභාවයක් පෙන්නුම් කරයි (රූපය 1b).NT ජෙල් සුවිශේෂී ලෙස පැහැදිලි වන අතර අනෙකුත් ජෙල් පාරාන්ධ වේ.ඔහුගේ-NT2RepCT සහ NT ජෙල් සිලින්ඩරාකාර නල වලට වාත්තු කරන ලද අච්චුවෙන් නොවෙනස්ව ඉවත් කළ හැකිය (රූපය 1d).
ප්‍රතිසංයෝජක ස්පයිඩ්‍රොයින් ප්‍රෝටීන වල ජෙලීකරණයට හේතු වන බව දැන් සොයාගෙන ඇති තත්වයන් යටතේ ස්වාභාවික මකුළු සේද ආලේපන ජෙල් දැයි පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, ස්වීඩන් පාලම් මකුළුවාගේ (Larinioides sclopetarius) විශාල ඇම්පුලා ග්‍රන්ථියෙන් ආලේපන එකතු කරන ලදී.ආෙල්පන 20 mM Tris-HCl බෆරයක 50 mg/mL (මනින ලද වියළි බර මත පදනම්ව) ගබඩා කර ඇත, නමුත් 37 °C දී දින 21 ක ඉන්කියුබේෂන් තුළ ජෙලේෂන් නිරීක්ෂණය නොකළේය (පරිපූරක රූපය 2a).
මෙම ජෙල් ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා, ජෙලිකරණ ක්‍රියාවලිය අධ්‍යයනය කිරීමට සහ සමස්ත යාන්ත්‍රික ගුණාංග තීරණය කිරීමට භූ විද්‍යාත්මක මිනුම් භාවිතා කළ හැකිය.විශේෂයෙන්ම, ඉහළ උෂ්ණත්වවලදී ගබඩා කිරීමේ මාපාංකය (ප්රත්යාස්ථතාව) නිරීක්ෂණය කිරීම මගින් gelling උෂ්ණත්වය මෙන්ම ආලේපනයේ viscoelastic ගුණයන් පිළිබඳ තොරතුරු සැපයිය හැකිය.උෂ්ණත්වය ඉහළ යාමේ අත්හදා බැලීම් (ස්වාභාවික සේද තොග විසඳුම් භාවිතා කරමින් පෙර අධ්‍යයනයන් මත පදනම්ව 25-45 ° C දී 1 ° C/min භාවිතා කිරීම) 40,41 පෙන්නුම් කළේ උෂ්ණත්වය වැඩි වීමත් සමඟ His-NT2RepCT සහ NT ද්‍රාවණවල ගබඩා මාපාංකය වැඩි වන බවයි.වැඩි කරන ලදී (රූපය 2 සහ පරිපූරක රූපය 3).කැපී පෙනෙන ලෙස, NT මොඩියුලය His-NT2RepCT හා සසඳන විට අඩු උෂ්ණත්වයකින් වර්ධනය වීමට පටන් ගත් අතර, NT සෘජුවම His-NT2RepCT සමඟ 37°C දී පුර්වාතනය කළ විට නිරීක්ෂණය කරන ලද වේගවත් ජෙල් කාලයට අනුකූල වේ (රූපය 1).පසුව උෂ්ණත්වය පහත වැටීමෙන් පසුව, ගබඩා මාපාංකය අඩු අගයන් වෙත ආපසු නොපැමිණෙන අතර පාඩු මාපාංකයට වඩා ඉහළින් පැවතුනි (පරිපූරක රූපය. 3 බලන්න), තාපයෙන් ආපසු හැරවිය නොහැකි ස්ථායී ජෙලේෂන් පෙන්නුම් කරයි.ජෙලේෂන් කිරීමෙන් පසුව, අවසාන ප්‍රත්‍යාස්ථ මාපාංකය 100-500 mg/mL සාන්ද්‍රණයකින් His-NT2RepCT හයිඩ්‍රොජෙල් සඳහා 15 සිට 330 kPa දක්වා වූ අතර NT හයිඩ්‍රොජෙල් (100-500 mg/mL) සඳහා අවසාන ප්‍රත්‍යාස්ථ මාපාංකය 2 සිට 1400 දක්වා පරාසයක පවතී. kPa (Fig. , 2 සහ සම්පූර්ණ බෑවුම් දත්ත) පරිපූරක Fig. 3 බලන්න).
a His-NT2RepCT (300 mg/mL) සහ b NT (300 mg/mL) කම්පන සමඟ මැනීමේදී උෂ්ණත්වය වෙනස් වීම.ඊතල මඟින් උෂ්ණත්ව ප්‍රවණතාවය පෙන්නුම් කරන අතර ගබඩා මොඩියුලයේ දත්තවල සැහැල්ලු සෙවන මඟින් නිෂ්පාදකයා විසින් නිශ්චිතව දක්වා ඇති ප්‍රමාණයට වඩා අඩු ව්‍යවර්ථ අගයකින් උපකරණය පරීක්ෂා කිරීම නිරූපණය කරයි, එය ශබ්දය වැඩි වීමට හේතුවයි.c උස් වූ උෂ්ණත්වය (100, 300, සහ 500 mg/mL) පසු His-NT2RepCT සහ NT අවසන්-මොඩියුල සමුච්චය වීම.සියලුම මොඩියුල කියවීම් 0.1 Hz සංඛ්යාතයකින් ගනු ලැබේ.
ජෙලේෂන් හා සම්බන්ධ අනුකූල වෙනස්කම් විමර්ශනය කිරීමේ විභව ක්‍රමයක් ලෙස, අපි ඔහුගේ-NT2RepCT සහ NT වල FTIR වර්ණාවලි 37°C දී ජෙලේෂන් කිරීමට පෙර සහ පසු වාර්තා කළෙමු (රූපය 3a,b).අපේක්ෂා කළ පරිදි, His-NT2RepCT සහ NT ද්‍රාවණවල වර්ණාවලි α-helix/අහඹු දඟර ද්විතියික ව්‍යුහය පෙන්වන ප්‍රෝටීන වලට අනුරූප වන අතර, 1645 cm-1 දී උච්චාරණය කරන ලද කලාපයක් ඇත.හයිඩ්‍රොජෙල් දෙක සඳහාම, ජෙලේෂන් ප්‍රතිඵලය වූයේ මැද I කලාපයේ 1617 cm-1 සහ 1695 cm-1 (පය. 3a, b) වලදී අත් දෙකක් සෑදීමයි.මෙම වෙනස්කම් අදාළ දෙවන ව්‍යුත්පන්න සහ වෙනස ජෙලේෂන් වර්ණාවලියේ ද පැහැදිලිව දැකගත හැකිය (පරිපූරක Fig. 4b).NT β-ස්ථරයෙහි පටි දෙක His-NT2RepCT ට වඩා ප්‍රකට විය, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ NT හයිඩ්‍රොජෙල් හි β-ස්ථර කලාපවල සම්පූර්ණ අන්තර්ගතය NT2RepCT හයිඩ්‍රොජෙල්ට වඩා වැඩි බවයි.
ඔහුගේ-NT2RepCT සහ b NT (විසඳුම) සහ පසු (ජෙල්) 37 ° C දී ඉන්කියුබේෂන් පසු (දෙකම 500 mg/mL) FTIR අවශෝෂණ වර්ණාවලි.c නැවත ලබා දුන් 50 mg/ml NT2RepCT ජෙල් සහ d NT වල TEM රූප.පරිමාණ තීරුව 200 nm.e His-NT2RepCT සහ NT හයිඩ්‍රොජෙල් වල තන්තු විෂ්කම්භය.n = 100 මනින ලද තන්තු, p <0.0001.දෝෂ තීරු සම්මත අපගමනය පෙන්වයි.දෝෂ තීරුවල කේන්ද්රය මධ්යන්යය වේ.සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණය සඳහා යුගල නොකළ t-පරීක්ෂණයක් (වලිග දෙකකින් යුත්) භාවිතා කරන ලදී.f විවිධ ප්‍රතිසංයෝජක ස්පිඩ්‍රොයින් ප්‍රෝටීන වල (100 mg/mL) 37 °C දී සෙලවීමකින් තොරව ThT ප්‍රතිදීප්තතාව.0%, 5%, 10% සහ 20% බීජ සහිත 100 mg/mL NT ජෙල් වලින් g NT (100 mg/mL) එන්නත් කිරීමේ අත්හදා බැලීම්.
සම්ප්‍රේෂණ ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂය (TEM) භාවිතයෙන් ජෙල් විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ හයිඩ්‍රොජෙල් ඇමයිලොයිඩ් වැනි ෆයිබ්‍රිල් වලින් සමන්විත වන බවයි (රූපය 3c, 3d).NT-සාදන ලද ෆයිබ්‍රිල් දිගටි (විෂ්කම්භය 5-12 nm) සහ අතු විරහිත වූ අතර, His-NT2RepCT ෆයිබ්‍රිල්ස් දිගෙන් කෙටි වූ අතර විෂ්කම්භයෙන් සැලකිය යුතු ලෙස පුළුල් විය (7-16 nm) (රූපය 3e).මෙම ප්‍රතිඵල මගින් අපට thioflavin T (ThT) විශ්ලේෂණය භාවිතා කරමින් ෆයිබ්‍රෝසිස් වල චාලක විද්‍යාව අනුගමනය කිරීමට හැකි විය.සියලුම ප්‍රතිසංයෝජක ස්පීඩ්‍රොයින් ප්‍රෝටීන සඳහා, සාම්පල 37 °C දී ඉන්කියුබේෂන් කළ විට ප්‍රතිදීප්ත සංඥාව වැඩි විය (රූපය 3f, පරිපූරක Fig. 5a).මෙම සොයාගැනීම්වලට අනුකූලව, ජෙලිං තත්ත්‍වයන් යටතේ NT සහ His-NT2RepCT හි අන්වීක්ෂීය පරීක්‍ෂණයේදී ThT-ධනාත්මක සමූහවල සැලකිය යුතු දේශීය සමුච්චයක් නොමැතිව ThT ප්‍රතිදීප්තියේ ඒකාකාර වැඩි වීමක් අනාවරණය විය (පරිපූරක Fig. 5b,c).ThT-ධනාත්මක තන්තු සෑදීම NT සහ His-NTCT turbidity (පරිපූරක Fig. 5d) හි වැඩි වීමක් සමඟ සිදු නොවීය, එයින් අදහස් කරන්නේ ජෙල් පැහැදිලිතාවයට බාධා නොකර ජෙල් තුළ ඇති තන්තු ජාලයක් සෑදිය හැකි බවයි.කලින් සාදන ලද ෆයිබ්‍රිල් කුඩා ප්‍රමාණයක් එකතු කිරීමෙන් බීජ කිරීම සමහර ඇමයිලොයිඩ් 42,43,44 ෆයිබ්‍රිල් සෑදීම සැලකිය යුතු ලෙස වේගවත් කළ හැකි නමුත් NT හයිඩ්‍රොකෝගුලන්ට් ද්‍රාවණයකට 5%, 10% හෝ 20% (w/w) NT එකතු කරයි.බීජ කිරීමේ බලපෑම (රූපය 3g).සමහර විට මෙය හයිඩ්‍රොජෙල් වල ඇති තන්තු සාපේක්ෂ වශයෙන් සවි කර ඇති අතර බීජ ලෙස භාවිතා කළ නොහැක.
ඉහළ උෂ්ණත්වවලදී ප්‍රතිසංයෝජක ස්පීඩ්‍රොයින් ප්‍රෝටීන වල අනපේක්ෂිත හැසිරීම ජෙල් සෑදීම හා සම්බන්ධ අනුකූල වෙනස්කම් හඳුනා ගැනීම සඳහා තවදුරටත් න්‍යෂ්ටික චුම්භක අනුනාද (NMR) වර්ණාවලීක්ෂ අධ්‍යයනයන් පොළඹවන ලදී.කාලයත් සමඟ 37°C හි වාර්තා කරන ලද His-NT2RepCT විසඳුම්වල NMR වර්ණාවලිය පෙන්නුම් කළේ CT තවමත් අර්ධ වශයෙන් නැවී ඇති අතර NT සහ 2Rep සංඥා අතුරුදහන් වී ඇති බවයි (රූපය 4a), එය ප්‍රධාන වශයෙන් NT සහ 2Rep අර්ධ වශයෙන් පාලනය කරන ලද His- සෑදීම බව යෝජනා කරයි. NT2RepCT හයිඩ්‍රොජෙල්.CT සංඥාව එහි මුල් තීව්‍රතාවයෙන් 20% දක්වා අඩු කරන ලද අතර, CT ද බොහෝ දුරට සවි කර ඇති අතර හයිඩ්‍රොජෙල් ව්‍යුහයට ඇතුළත් කර ඇති බව යෝජනා කරයි.පූර්ව ඉන්කියුබේටඩ් නියැදියේ මෙන් ජංගම වන සහ එන්එම්ආර් ද්‍රාවණය මගින් නිරීක්ෂණය කරන ලද CT හි කුඩා කොටස සඳහා, වර්ණාවලියේ පළමු ව්‍යුහගත අපද්‍රව්‍ය 10 සඳහා සංඥා නොමැත, සමහර විට His-NT2Rep හි අමුණා ඇති කොටසෙහි දුෂ්කර ප්‍රතිචක්‍රීකරණය හේතුවෙන් විය හැකිය.හයිඩ්‍රොජෙල්ස් -NT2RepCT හි NMR වර්ණාවලිය මගින් α-හීලිස් සහ β-ස්ථරවල ප්‍රමුඛ පැවැත්ම සහ අඩු ප්‍රමාණයකට අහඹු දඟර අනුකූලතාව (පය. 4b) අනාවරණය විය.NT හි පමණක් පවතින මෙතියොනීන් අපද්‍රව්‍යවල රසායනික මාරු විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ මෙම වසම β-පත්‍ර ව්‍යුහයක් බවට පරිවර්තනය කර ඇති බවයි.ද්‍රාවණයේ ඇති NT හි කාලය මත යැපෙන වර්ණාවලි සංඥා තීව්‍රතාවයේ ඒකාකාර අඩුවීමක් පෙන්නුම් කරයි (රූපය 4c), සහ NT හයිඩ්‍රොජෙල් වල ඝන තත්වයේ NMR මගින් පෙන්නුම් කළේ NT අපද්‍රව්‍ය බොහොමයක් β-ෂීට් ව්‍යුහයන් බවට පරිවර්තනය කර ඇති බවයි (රූපය 4d).2Rep හි අනුකූලතාව එහි එකතු වීමේ ප්‍රවණතාව හේතුවෙන් වෙන වෙනම තීරණය කළ නොහැක.කෙසේ වෙතත්, NTCT සහ His-NT2RepCT හයිඩ්‍රොජෙල් වල ඝන තත්වයේ NMR වර්ණාවලි ඉතා සමාන විය (රූපය 4b; පරිපූරක Fig. 6b), ඔහුගේ-NT2RepCT හයිඩ්‍රොජෙල්හි ව්‍යුහාත්මක කොටස සඳහා 2Rep දායක වූයේ ඉතා සුළු බව ය.CT හයිඩ්‍රොජෙල් සඳහා, α-හීලිස්, β-ෂීට් සහ අහඹු හෙලික්සීය ද්විතියික ව්‍යුහයන් පවතින බව සොයා ගන්නා ලදී (පරිපූරක Fig. 6d).මෙයින් ඇඟවෙන්නේ CT හි සමහර කොටස් α-හීලිස් ලෙස පවතින අතර අනෙක් ඒවා β-ෂීට් බවට පත් වන බවයි.මේ අනුව, NMR වර්ණාවලීක්ෂයේ ප්‍රතිඵල යෝජනා කරන්නේ NT හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදීම සඳහා වැදගත් වන අතර 2Rep සහ CT සමඟ විලයනය වීම මත β-පත්‍ර අනුකූලතාවක් බවට පරිවර්තනය වන බවයි.මෙයට අනුකූලව, NT වසමේ හෙලිස් පහේම ඇමයිලොයිඩ් අවකාශීය සිපර් සෑදිය හැකි බව අපි මෑතකදී සොයා ගත් අතර, Waltz ඇල්ගොරිතම මගින් helix 1 හි ඇමයිලොයිඩොජනික් කලාපයක් පුරෝකථනය කරන ලදී (රූපය 4e).
2D වර්ණාවලි 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT ද්‍රාවණයට පෙර (නිල්) සහ පැය 19 කට පසු (රතු) 37 ° C දී.රතු වර්ණාවලියේ තනි පුද්ගල හරස් ශිඛර සහ නිල් වර්ණාවලියේ F24, G136, polyA තනි අකුර ඇමයිනෝ අම්ල සංකේත සහ අවශේෂ අංක වලින් දැක්වේ.NT, 2Rep, සහ CT වසම් වලින් තෝරාගත් අවශේෂ සඳහා නියමිත වේලාවට සංඥා තීව්‍රතාවයේ යැපීම ඇතුළත් කිරීම් පෙන්වයි.b His-NT2RepCT හයිඩ්‍රොජෙල් වල ඝන-රාජ්ය රේඩියෝ සංඛ්‍යාත (RFDR) වර්ණාවලි.RFDR වර්ණාවලියේ නිරීක්ෂණය කරන ලද Cα/Cβ අපද්‍රව්‍යවල සහසම්බන්ධතා නිශ්චය කර ඇත්තේ ආදර්ශ පෙප්ටයිඩ රසායනික මාරුවීම් සහ සංඛ්‍යාලේඛන82,83 සහ ඒවායේ ද්විතියික ව්‍යුහයන්ගෙන් ලබාගත් අගයන් සමඟ සංසන්දනය කිරීමෙනි.SSB - භ්රමණය වන පැති පටිය.c 15N-HSQC 10 mg/mL NT ද්‍රාවණයේ ඒකමාන වර්ණාවලි පැය 36ක් සඳහා 37 °C දී ඉන්කියුබේෂන් කිරීමේදී.ඇතුල් කිරීම කාලයට සාපේක්ෂව පරිමාමිතික තීව්‍රතාවය පෙන්වයි.d NT හයිඩ්‍රොජෙල් වල ඝන තත්වයේ RFDR වර්ණාවලිය.RFDR වර්ණාවලියේ නිරීක්ෂණය කරන ලද Cα/Cβ අපද්‍රව්‍යවල සහසම්බන්ධතා සහ ඒවායේ ද්විතියික ව්‍යුහයන් දක්වා ඇත.e Zipper දත්ත ගබඩාවෙන් (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT45.79 fibrillation ප්‍රවණතා පැතිකඩ මත පදනම්ව.හෙක්සැපෙප්ටයිඩයේ අවකාශීය අකුණු මාරු කවුළුවේ රොසෙටා ශක්තිය kcal/mol වලින් දැක්වේ.රතු තීරු ඉහළ ෆයිබ්‍රෝසිස් ප්‍රවණතාවක් සහිත හෙක්සැපෙප්ටයිඩ දක්වයි (රොසෙටා ශක්තිය -23 kcal/mol ට අඩු; තිත් රේඛාවට පහළින්).හරිත තීරු මඟින් එළිපත්තට ඉහළින් රොසෙටා ශක්තීන් සහිත කොටස් පෙන්නුම් කරන අතර එම නිසා ස්ටීරික් සිපර් සෑදීමට ඇති ඉඩකඩ අඩුය.ප්‍රෝලීන් අඩංගු කොටස් විශ්ලේෂණයෙන් (තීරු නොමැතිව) බැහැර කර ඇත.වෝල්ට්ස් ඇල්ගොරිතම 81 (https://waltz.switchlab.org) මගින් පුරෝකථනය කරන ලද ඇමයිලොයිඩෝසිස් ප්‍රදේශ වර්ග දක්වයි.NT හි ඇමයිනෝ අම්ල අපද්‍රව්‍යවල අනුපිළිවෙල ඉහළින් ඇති අතර β ද්විතියික ව්‍යුහයේ (ඝන තත්වයේ NMR වර්ණාවලීක්ෂය මගින් තීරණය කරනු ලබන) අපද්‍රව්‍ය වර්ග රතු පැහැයෙන් දැක්වේ.NT α-හීලිස් පහේ ස්ථාන (H1-H5)28 ලෙස නම් කර ඇත.
PH <6.5 දී, HT dimerizes, තාපය හෝ යූරියා-ප්රේරිත denaturation18.NT dimerization සහ ස්ථායීතාවය ජෙලේෂන් වලට බලපාන්නේ කෙසේද යන්න පැහැදිලි කිරීම සඳහා, 100 mg/ml NT අඩංගු ද්‍රාවණ pH 8, 7 සහ 6 වලදී කුප්පි ප්‍රතිලෝම පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් පාලනය කරන ලදී.NT සාම්පල pH 8 සහ 7 ට විනාඩි 30 කට පසු 37 °C දී ජෙල් කරන ලදී, නමුත් pH 8 ජෙල් පැහැදිලිව පැවතුන අතර pH 7 ජෙල් දෘශ්‍ය අවක්ෂේපයක් පෙන්නුම් කළේය (රූපය 5a).ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, PH 6 හි HT අඩංගු ද්‍රාවණයක් ජෙල් සෑදී නැති අතර 37 ° C දී මිනිත්තු 20 කට පසුව විශාල අවක්ෂේපයක් දැකිය හැකිය.මොනෝමර් හා සසඳන විට ඩිමර් සහ/හෝ ඒවායේ ඉහළ ස්ථායීතාවය ජෙලේෂන් වළක්වන බව මෙයින් ඇඟවෙයි.NT 200 mg/ml27 දී ද්‍රාව්‍ය වන බවත්, තාප පිරිහීමෙන් පසු පහසුවෙන් ප්‍රතිවර්තනය වන බවත්, අඩු අගයන්හිදී α-helix රඳවා ගන්නා බවත් වාර්තා වී ඇති බැවින්, pH 7 සහ 6 හි NT සඳහා අවක්ෂේපයක් ඇති වීම අපේක්ෂා නොකළේය. pH 18. මෙම විෂමතා සඳහා විය හැකි පැහැදිලි කිරීමක් නම්, කලින් වාර්තා කරන ලද පරීක්ෂණ කාමර උෂ්ණත්වයේ හෝ ඊට අඩු හෝ සාපේක්ෂව අඩු ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණයක 16,18,19 සිදු කර ඇති බවයි.
NT කුප්පි ප්‍රතිලෝම පරීක්ෂණය (100 mg/mL) pH 8, 7, 6 සහ 154 mM NaCl (pH 8) 37 ° C දී පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමෙන් පසුව.b NT CD වර්ණාවලිය පිළිවෙළින් 154 mM NaF සහ 154 mM NaCl සහිත සහ රහිත.222 nm හි මවුල ඉලිප්සාකාරය ස්වභාවික නැමීම්වල අනුපාතයකට පරිවර්තනය වේ.c NT ප්‍රතිලෝම විශ්ලේෂණය (100 mg/mL) NT* (37 °C සහ 60 °C), NTA72R (37 °C), සහ His-NT-L6 (37 °C සහ 60 °C).d NT විකෘති NT*, NTA72R, සහ His-NT-L6 හි CD වර්ණාවලි.222 nm හි මවුල ඉලිප්සාකාරය ස්වභාවික නැමීම්වල අනුපාතයකට පරිවර්තනය වේ.ඊ NTFlSp, NTMiSp සහ අඩු කළ NTMiSp (100 mg/mL) හි ප්‍රතිලෝම පරීක්ෂණය.පරිමාණ තීරුව 5 මි.මී.f CD වර්ණාවලිය NT, NTFlSp, NTMiSp සහ අඩු කළ NTMiSp.222 nm හි මවුල ඉලිප්සාකාරය ස්වභාවික නැමීම්වල අනුපාතයකට පරිවර්තනය වේ.25 °C සහ 95 °C දී සම්පූර්ණ NT වර්ණාවලි පරිපූරක රූප සටහන 8 හි පෙන්වා ඇත.
කායික ලුණු සාන්ද්‍රණය NT උප ඒකක අතර විද්‍යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්‍රියා සහ NT හුවමාරුව අඩු pH18 වෙත ඩයිමර්කරණය කිරීම තීරණය කරයි.154 mM NaCl සහ NaF තිබීම පිළිවෙලින් ජෙලේෂන් වලක්වන බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය 5a, b; පරිපූරක Fig. 2b) සහ මෙම ලවණ NT මොනෝමර් වල තාප ස්ථායීතාවය වැඩි කරන බව (රූපය 5b, අතිරේක රූපය 8) .ඩිමරීකරණයට වඩා ස්ථායීතාවය වැඩි දියුණු කිරීම ජෙල් සෑදීම වළක්වන බව ද එය යෝජනා කරයි.
ප්‍රෝටීන් ඩයිමරීකරණයේ සහ ජෙලේෂන් හි ස්ථායීතාවයේ කාර්යභාරය තවදුරටත් ගවේෂණය කිරීම සඳහා, අපි NT* සහ NTA72R යන විකෘති දෙකක් භාවිතා කළ අතර, ඒවාද අඩු pH28.30 හි මොනොමරික් ලෙස පවතී.NT* යනු ද්විත්ව ආරෝපණ ප්‍රතිවර්තන විකෘතියක් වන අතර, මොනෝමරයේ දෘශ්‍ය ද්විධ්‍රැව ආරෝපණ ව්‍යාප්තිය සමතලා කර ඇති අතර, එය dimerization වළක්වන අතර මොනෝමර් ස්ථායීතාවය දැඩි ලෙස වැඩි කරයි.NTA72R යනු ආරෝපිත ද්වි ධ්‍රැවයකි, නමුත් Arg-ආදේශක Ala පිහිටා ඇත්තේ dimer මායිමේ, එබැවින් dimerization සඳහා අවශ්‍ය අනු ඒකක අන්තර්ක්‍රියා වලට විකෘති බාධා කරයි.37°C දී ඉන්කියුබේෂන් කිරීමෙන් පසු, NT* හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදුවේ නැත, NTA72R මිනිත්තු 15ක් සඳහා පාරාන්ධ ජෙල් සෑදුවේය (රූපය 5c).NT* සහ NTA72R දෙකම dimerize කළ නොහැකි නමුත් මොනෝමර් ස්ථායීතාවයෙන් වෙනස් වේ (රූපය 5d), මෙම ප්‍රතිඵල දැඩි ලෙස යෝජනා කරන්නේ ඉහළ තාප ගතික ස්ථායීතාවය NT ජෙලිං වීම වළක්වන බවයි.HT* ඉහළ උෂ්ණත්වයකදී අස්ථායී වූ විට ජෙල් සාදයි (මිනිත්තු 8 කට පසු 60 ° C; Fig. 5c) යන කරුණ මෙයට සහාය වේ.NT හි ඇති ඉහළ මෙතියොනීන් අන්තර්ගතය එහි ස්වාභාවික නැමීම ද්‍රවීකරණය කරන බවත් Met to Leu ආදේශක හයක් (His-NT-L6 ලෙස මෙහි සඳහන් වේ) NT46 මොනෝමරය දැඩි ලෙස ස්ථායීකරන බවත් කලින් පෙන්වා දී ඇත.NT ජෙල් සෑදීම සඳහා ව්‍යුහාත්මක නම්‍යශීලීභාවය අවශ්‍ය යැයි උපකල්පනය මත පදනම්ව, His-NT-L6 ස්ථායී විකෘතිය 37 °C දී ජෙල් නොවන බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය 5c, d).කෙසේ වෙතත්, His-NT-L6 ද විනාඩි 60 ක් සඳහා 60 ° C දී ඉන්කියුබේෂන් මත ජෙල් සෑදී ඇත (රූපය 5c).
NT ට β-පත්‍ර ව්‍යුහයන් බවට පරිවර්තනය කිරීමට සහ හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදීමට ඇති හැකියාව ස්පීඩ්‍රොයින් හි සමහර නමුත් සියලුම NT වසම් සඳහා අදාළ නොවන බව පෙනේ.විවිධ සේද වර්ග සහ මකුළු විශේෂ වලින් NTs, Trichonephila clavipes (NTFlSp), සාපේක්ෂ වශයෙන් අඩු මෙතියොනීන් අන්තර්ගතය සහ ඉහළ තාප ස්ථායීතාවය තිබියදීත් ජෙල් සෑදී ඇත (රූපය 5e, f සහ අතිරේක වගුව 2).ඊට වෙනස්ව, අඩු තාප ස්ථායීතාවයක් සහ ඉහළ මෙතියොනීන් අන්තර්ගතයක් සහිත Araneus ventricosus (NTMiSp) වෙතින් කුඩා ඇම්ප්ලර් ප්‍රෝටීන් ස්පීඩ්‍රොයින් වලින් NT හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදුවේ නැත (පරිපූරක වගුව 2 සහ Fig. 5e, f).දෙවැන්න අන්තර් අණුක ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන 29,47 තිබීම සමඟ සම්බන්ධ විය හැකිය.NTMiSp හි ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන අඩු වූ විට, එය විනාඩි 10 ක් සඳහා 37 ° C දී ඉන්කියුබේෂන් කිරීමෙන් පසු හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදී ඇත (රූපය 5e).අවසාන වශයෙන්, NT වලින් ජෙල් සෑදීම සඳහා ව්යුහාත්මක නම්යශීලීභාවය වැදගත්, නමුත් එකම නිර්ණායකයක් නොවන බව සැලකිල්ලට ගත යුතුය.අදාළ විය හැකි තවත් සාධකයක් වන්නේ ඇමයිලොයිඩ් ෆයිබ්‍රිල් සෑදීමේ ප්‍රවණතාවය වන අතර සිපර් දත්ත සමුදාය සහ වෝල්ට්ස් ඇල්ගොරිතම සමඟ විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් ජෙල් සෑදීමේ හැකියාව සහ ඇමයිලොයිඩොජනික් කලාප තිබීම මෙන්ම පුරෝකථනය කළ කලාපවල ප්‍රමාණය අතර සහසම්බන්ධයක් පෙන්නුම් කරයි. ස්ටීරික් සිපර් සෑදීමට.සහසම්බන්ධයක් තිබුණි (පරිපූරක වගුව 2 සහ පරිපූරක රූපය 9).
NT ට හිතකර තත්ව යටතේ ෆයිබ්‍රිල් සෑදීමට සහ ජෙල් සෑදීමට ඇති හැකියාව, අනෙකුත් ප්‍රෝටීන් කොටස් සමඟ NT විලයනයන් තවමත් විලයන හවුල්කරුවන්ගේ සම්පූර්ණ ක්‍රියාකාරිත්වය සහිත ජෙල් සෑදිය හැකි බව උපකල්පනය කිරීමට අපව යොමු කළේය.මෙය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි පිළිවෙලින් NT හි C-පර්යන්තයේදී හරිත ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන් (GFP) සහ පියුරීන් නියුක්ලියෝසයිඩ් ෆොස්ෆොරිලේස් (PNP) හඳුන්වා දුන්නෙමු.එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස විලයන ප්‍රෝටීන ඉතා ඉහළ අවසාන අස්වැන්නක් සහිතව E. coli හි ප්‍රකාශ කරන ලදී (පිළිවෙලින් ඔහුගේ-NT-GFP සහ His-NT-PNP සඳහා 150 mg/L සහ 256 mg/L ෂේක් ප්ලාස්ක් සංස්කෘතීන්), පෙන්වා ඇති දේට අනුකූල වේ. NT Ref වෙත විලයනය වූ අනෙකුත් ප්‍රෝටීන සඳහා.30. His-NT-GFP (300mg/mL) සහ His-NT-PNP (100mg/mL) විලයන ප්‍රෝටීන පැය 2ක් සහ පැය 6.5කට පසු 37°C දී ජෙල් සෑදූ අතර, වැදගත් ලෙස, GFP කොටස නොවෙනස්ව පැවතුනි.ජෙලේෂන් කිරීමෙන් පසු නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර, මූලික ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවයෙන් 70% ක් ජෙලේෂන් කිරීමෙන් පසුව ඉතිරිව ඇත (රූපය 6a).ඔහුගේ-NT-PNP විසඳුම් සහ ජෙල් වල PNP ක්‍රියාකාරකම් මැනීමට, අපට විලයන ප්‍රෝටීනය NT සමඟ තනුක කිරීමට සිදු විය, මන්ද පිරිසිදු සූදානමේ එන්සයිම ක්‍රියාකාරිත්වය ජෙලිං සාන්ද්‍රණයේදී විශ්ලේෂණයේ හඳුනාගැනීමේ පරාසයෙන් පිටත වූ බැවිනි.0.01 mg/mL His-NT-PNP සහ 100 mg/mL NT අඩංගු මිශ්‍රණයක් සමඟ සාදන ලද ජෙල් පූර්ව නිශ්චල සාම්පලවල ආරම්භක එන්සයිම ක්‍රියාකාරකම් වලින් 65% ක් රඳවා ගෙන ඇත (රූපය 6b).මැනීමේදී ජෙල් නොවෙනස්ව පැවතුනි (පරිපූරක රූපය 10).
ඔහුගේ-NT-GFP (300 mg/mL) ජෙලේෂන් කිරීමට පෙර සහ පසු සාපේක්ෂ ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය සහ දෘශ්‍ය සහ UV ආලෝකය යටතේ His-NT-GFP හයිඩ්‍රොජෙල් (300 mg/mL) අඩංගු ප්‍රතිලෝම කුප්පිය.ලකුණු තනි මිනුම් පෙන්වයි (n = 3), දෝෂ තීරු සම්මත අපගමනය පෙන්වයි.සාමාන්‍ය අගය දෝෂ තීරුවල මධ්‍යයේ දැක්වේ.b PNP ක්‍රියාකාරකම් NT (100 mg/ml) සහ 0.01 mg/ml his-NT-PNP සහ 100 mg/ml නිව් තායිවාන් ඩොලර් අඩංගු මිශ්‍රණයකින් සමන්විත විසඳුම් සහ ජෙල් භාවිතයෙන් ප්‍රතිලෝමමිතික විශ්ලේෂණය මගින් ලබා ගන්නා ලදී.ඇතුළුව ඔහුගේ-NT-PNP (5 mm පරිමාණ තීරුව) අඩංගු හයිඩ්‍රොජෙල් අඩංගු ප්‍රතිලෝම කුප්පියක් පෙන්වයි.
මෙහිදී, 37°C දී ප්‍රෝටීන් ද්‍රාවණයක් පුර්වකාශනය කිරීමෙන් NT සහ අනෙකුත් ප්‍රතිසංයෝජක ස්පයිඩ්‍රොයින් ප්‍රෝටීන වලින් හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදීම වාර්තා කරමු (රූපය 1).අපි පෙන්වන්නේ ජෙලේෂන් α-හීලිස් β-ස්ථර බවට පරිවර්තනය කිරීම සහ ඇමයිලොයිඩ් වැනි ෆයිබ්‍රිල් සෑදීම සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති බවයි (රූපය 3 සහ 4).NTs යනු ඉතා ඉහළ ද්‍රාව්‍යතාවක් සහ සාන්ද්‍රණයකදී 200 mg/mL > 4°C දී දින කිහිපයක් සඳහා ඉහළ ස්ථායීතාවක් සහිත දඟර සහිත ගෝලාකාර පහේ හෙලික්ස් මිටි බැවින් මෙම සොයා ගැනීම පුදුම සහගතය.මීට අමතරව, NTs µM හි අඩු ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණයකදී තාප පිරිහීමෙන් පසු පහසුවෙන් ප්‍රතිවර්තනය වේ.අපගේ ප්‍රතිඵලවලට අනුව, ෆයිබ්‍රිල් සෑදීමට අවශ්‍ය වන්නේ >10 mg/mL ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණය සහ තරමක් ඉහළ උෂ්ණත්වය (රූපය 1).මෙය භෞතික විද්‍යාත්මක තත්ත්‍වයන් යටතේ තාප උච්චාවචනයන් හේතුවෙන් අර්ධ වශයෙන් දිග හැරෙන තත්වයක පවතින ගෝලාකාර ලෙස නැමුණු ප්‍රෝටීන වලින් ඇමයිලොයිඩ් ෆයිබ්‍රිල් සෑදිය හැකිය යන අදහසට අනුකූල වේ.මෙම පරිවර්තනයට භාජනය වන ප්‍රෝටීන සඳහා උදාහරණ ලෙස insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin සහ lysozyme51,52,53 ඇතුළත් වේ.NT යනු එහි නිජබිමෙහි α-helix වුවද, පොලිපෙප්ටයිඩ දාමයෙන් ආසන්න වශයෙන් 65%ක් ස්ටීරික් සිපර් සෑදීමට අනුකූල වේ (රූපය 4e) 45 .මොනෝමරය ගතිකව ජංගම46 බැවින්, එය මධ්‍යස්ථව ඉහළ උෂ්ණත්වවලදී මෙම විභව ඇමයිලොයිඩොජනික් කලාප නිරාවරණය කළ හැකි අතර සම්පූර්ණ ප්‍රෝටීන් ඉහළ සාන්ද්‍රණයකදී ඇමයිලොයිඩ් ෆයිබ්‍රිල් සෑදීම සඳහා තීරණාත්මක සාන්ද්‍රණයකට ළඟා විය හැකිය.මෙම තර්කය අනුගමනය කරමින්, අපි ස්පීඩ්‍රොයින් සාන්ද්‍රණය සහ ජෙලේෂන් කාලය අතර සෘණ සහසම්බන්ධයක් සොයා ගත්තෙමු (රූපය 1c), සහ මොනොමරික් NT අනුකූලතාව විකෘති (NT*, His-NT-L6) මගින් හෝ ලුණු එකතු කිරීම මගින් ස්ථායීකරණය කරන්නේ නම්, එය වළක්වා ගත හැක. හයිඩ්රොජෙල් සෑදීම (රූපය 5).
බොහෝ අවස්ථාවන්හීදී, ඇමිලොයිඩ් ෆයිබ්‍රිල් ද්‍රාවණයෙන් අවක්ෂේපයක් ලෙස අතුරුදහන් වේ, නමුත් යම් යම් තත්වයන් යටතේ ඒවා හයිඩ්‍රොජෙල් 55,56,57 සෑදිය හැක.හයිඩ්‍රොජෙල් සාදන ෆයිබ්‍රිල් සාමාන්‍යයෙන් ඉහළ දර්ශන අනුපාතයක් ඇති අතර අණුක පැටලීම හරහා ස්ථායී ත්‍රිමාන ජාල සාදයි, අපගේ ප්‍රතිඵලවලට අනුකූල 55,58.vitro හි හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදීම සඳහා, ප්‍රෝටීන බොහෝ විට සම්පූර්ණයෙන්ම හෝ අර්ධ වශයෙන් දිග හැරේ, උදාහරණයක් ලෙස, කාබනික ද්‍රාවකවලට නිරාවරණය වීම, අධික උෂ්ණත්වය (70-90 ° C) සහ/හෝ අඩු pH (1.5-3.0)59,60,61,62.මෙහි විස්තර කර ඇති ස්පීඩ්‍රොයින් හයිඩ්‍රොජෙල් සඳහා දැඩි සැකසුම් අවශ්‍ය නොවේ, හයිඩ්‍රොජෙල් ස්ථායී කිරීමට හරස් සම්බන්ධක කාරක අවශ්‍ය නොවේ.
සිල්ක් කරකැවීමේදී β-ෂීට් මාරුවට ලක්වන බව පෙනෙන ස්පයිඩ්‍රොයින් පුනරාවර්තන සහ QDs හයිඩ්‍රොජෙල් සාදන බව කලින් වාර්තා කර ඇත.අපගේ සොයාගැනීම් හා සසඳන විට, ඉන්කියුබේෂන් වේලාවන් සහ/හෝ ඉන්කියුබේෂන් උෂ්ණත්වය පිළිවෙළින් සැලකිය යුතු ලෙස දිගු හෝ වැඩි වූ අතර, එහි ප්‍රතිඵලය වූ හයිඩ්‍රොජෙල් බොහෝ විට පාරාන්ධ විය (රූපය 7 සහ අතිරේක වගුව 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. වේගවත් ජෙල් කාලවලට අමතරව, NT හයිඩ්‍රොජෙල් >300 mg/mL (30%) අනෙකුත් විස්තර කර ඇති ප්‍රතිසංයෝජක මකුළු සේද ප්‍රෝටීන් හයිඩ්‍රොජෙල් මෙන්ම ජෙලටින්, ඇල්ජිනේට් (2%), agar (0.5 %) වැනි ස්වභාවික හයිඩ්‍රොජෙල් අභිබවා ගියේය. ) සහ කොලජන්.(0.6%) (රූපය 7 සහ පරිපූරක වගු 1 සහ 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
මෙම අධ්‍යයනයේ දී හයිඩ්‍රොජෙල් වල ජෙල් කාලය සහ ප්‍රත්‍යාස්ථ මාපාංකය අනෙකුත් ස්පීඩ්‍රොයින් මත පදනම් වූ හයිඩ්‍රොජෙල් සහ තෝරාගත් ස්වාභාවික හයිඩ්‍රොජෙල් සමඟ සංසන්දනය කරන ලදී.ජෙලේෂන් තත්වයන් පිළිබඳ විස්තරයක් සමඟ යොමු කිරීම් ලබා දී ඇත.APS ඇමෝනියම් පර්සල්ෆේට්, කාමර උෂ්ණත්වය.දත්ත 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
මකුළුවන් ගබඩා කිරීමේදී ස්පීඩ්‍රොයින් ජෙල් වීම වැළැක්වීමට ක්‍රම දියුණු කර ඇති බව පෙනේ.සේද ග්‍රන්ථියේ ප්‍රෝටීන් ඉහළ සාන්ද්‍රණය තිබියදීත්, පර්යන්ත වසම හා සම්බන්ධ විශාල පුනරාවර්තන කලාපයෙන් අදහස් වන්නේ ග්‍රන්ථියේ NT සහ CT හි දෘශ්‍ය සාන්ද්‍රණය මෙම අධ්‍යයනයේ මායිමේදී ආසන්න වශයෙන් 10-20 mg / ml ට අනුරූප වන බවයි.in vitro නිරීක්ෂිත හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදීම සඳහා අවශ්‍ය වේ.මීට අමතරව, සේද ග්‍රන්ථිවල මෙන් ලවණවල සමාන සාන්ද්‍රණය 16 NT ස්ථාවර කර ඇත (රූපය 5b).NT අනුකූලතාව E. coli cytosol හි අධ්‍යයනය කර ඇති අතර එය vitro තුළ පරීක්ෂා කිරීමේදී වඩා තදින් නැවී ඇති බව සොයාගෙන ඇත, ලුණු හෝ වෙනත් සාධක vivo තුළ එය එකතු වීම වළක්වන බව තවදුරටත් පෙන්නුම් කරයි.කෙසේ වෙතත්, NTs වලට β-ෂීට් ෆයිබ්‍රිල් බවට පරිවර්තනය වීමේ හැකියාව සූතිකා සෑදීම සඳහා වැදගත් විය හැකි අතර අනාගත අධ්‍යයනයන්හිදී විමර්ශනය කළ යුතුය.
මෙම අධ්‍යයනයේ දී නිරීක්ෂණය කරන ලද NT-ඇමිලොයිඩ් වැනි ෆයිබ්‍රිල් සහ හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදීමේ නව අංග වලට අමතරව, මෙම සංසිද්ධියට ජෛව තාක්‍ෂණික සහ ජෛව වෛද්‍ය යෙදුම් තිබිය හැකි බව ද අපි පෙන්වමු (රූපය 8).සංකල්පයේ සාධනයක් ලෙස, අපි NT GFP හෝ PNP සමඟ ඒකාබද්ධ කළ අතර විලයන ප්‍රෝටීන් 37 °C දී පුර්වීකරණය කළ විට හයිඩ්‍රොජෙල් සාදන බවත් GFP සහ PNP භාග බොහෝ දුරට ජෙලේෂන් කිරීමෙන් පසුව ඒවායේ ක්‍රියාකාරිත්වය රඳවා ගන්නා බවත් පෙන්වා දුන්නෙමු (රූපය 6).නියුක්ලියෝසයිඩ් ෆොස්ෆොරිලේස් යනු නියුක්ලියෝසයිඩ් ඇනෙලොග් වල වැදගත් උත්ප්‍රේරක සංශ්ලේෂණය වන අතර එමඟින් අපගේ සොයා ගැනීම ජෛව ඖෂධ කර්මාන්තයට අදාළ වේ.හිතකර තත්ව යටතේ පාරදෘශ්‍ය හයිඩ්‍රොජෙල් සාදන විලයන ප්‍රෝටීන ප්‍රකාශ කිරීමේ සංකල්පය එන්සයිම නිශ්චලනය, පාලිත ඖෂධ මුදා හැරීම සහ පටක ඉංජිනේරු විද්‍යාව වැනි පුළුල් පරාසයක යෙදීම් සඳහා හිතකර ගුණ සහිත ක්‍රියාකාරී හයිඩ්‍රොජෙල් නිර්මාණය කිරීමට ඉඩ සලසයි.මීට අමතරව, NT සහ NT* යනු කාර්යක්ෂම ප්‍රකාශන මාර්කර් 30 වේ, එයින් අදහස් වන්නේ ද්‍රාව්‍ය විලයන ප්‍රෝටීන වල අධි-නිෂ්පාදන නිෂ්පාදනය සහ ත්‍රිමාණ හයිඩ්‍රොජෙල් වල නිශ්චල ඉලක්ක ප්‍රෝටීන සෑදීම සඳහා NT සහ එහි ප්‍රභේද භාවිතා කළ හැකි බවයි.
NT ද්‍රාව්‍ය, α-හෙලික්සීය සහ අඩු සාන්ද්‍රණයක (µM) සහ 37°C ස්ථායී වේ.එකම උෂ්ණත්වයකදී, නමුත් වැඩිවන සාන්ද්‍රණයකදී (>10 mg/ml), NT ඇමයිලොයිඩ් වැනි ෆයිබ්‍රිල් වලින් සමන්විත ජෙල් සාදයි.NT විලයන ප්‍රෝටීන ද පූර්ණ ක්‍රියාකාරී විලයන කොටස් සහිත ෆයිබ්‍රිලර් ජෙල් සාදයි, NT භාවිතයෙන් විවිධ ප්‍රෝටීන ත්‍රිමාණ හයිඩ්‍රොජෙල්වල නිශ්චල කිරීමට ඉඩ සලසයි.පහළ: NT (PDB: 4FBS) සහ තන්තු ජාල සහ ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන ව්‍යුහයන් පිළිබඳ නිදර්ශන (පරිමාණයට උපකල්පනය කර නැත, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.221RJ/pdpdbdb).
ඉදිකිරීම් (ඇමයිනෝ අම්ල අනුපිළිවෙල ඇතුළු සම්පූර්ණ ලැයිස්තුවක් සඳහා පරිපූරක වගුව 4 බලන්න) ප්ලාස්මිඩ් pT7 ක්ලෝන කර E. coli BL21 (DE3) බවට පරිවර්තනය කරන ලදී.ඉන්ජිනේරු ප්ලාස්මිඩ් අඩංගු E. coli කැනමයිසින් (70 mg/l) සමඟ පරිපූරණය කරන ලද Luria සුප් හොද්ද තුළ එන්නත් කරන ලද අතර 30 ° C සහ 250 rpm දී එක රැයකින් වගා කරන ලදී.ඉන්පසු සංස්කෘතිය කැනමයිසින් අඩංගු LB මාධ්‍යයට 1/100 එන්නත් කරන ලද අතර OD600 0.8 දක්වා ළඟා වන තෙක් 30 ° C සහ 110 rpm හි වගා කරන ලදී.NMR අධ්‍යයනය සඳහා, සමස්ථානික සමඟ ප්‍රෝටීන් ලේබල් කිරීම සඳහා D-ග්ලූකෝස් 13C (Aldrich) ග්‍රෑම් 2 ක් සහ ඇමෝනියම් ක්ලෝරයිඩ් 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) ග්‍රෑම් 1 ක් අඩංගු M9 අවම මාධ්‍යයේ බැක්ටීරියා වර්ධනය කරන ලදී.උෂ්ණත්වය සෙල්සියස් අංශක 20 දක්වා අඩු කර 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (අවසාන සාන්ද්‍රණය) සමඟ ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශනය ඇති කරන්න.එක රැයකින් ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශනයෙන් පසුව, සෛල 7278×g, 4°C විනාඩි 20ක් සඳහා නෙලා ගන්නා ලදී.සෛල පෙති 20 mM Tris-HCl, pH 8 හි නැවත ලබා දී, වැඩිදුර භාවිතය තෙක් ශීත කළ.දියවන ලද සෛල 30 kPa හි සෛල කඩාකප්පල්කාරකයක් (TS ශ්‍රේණි යන්ත්‍ර, Constant Systems Limited, England) භාවිතයෙන් ලිස් කරන ලදී.එවිට ලයිසේට් 4 ° C දී විනාඩි 30 ක් සඳහා ග්රෑම් 25,000 ක කේන්ද්රාපසාරී කර ඇත.NTMiSp සඳහා, පෙත්ත නැවත 2 M යූරියා, 20 mM Tris-HCl, pH 8, සහ විනාඩි 2 ක් (තත්පර 2 ක් සක්‍රිය / අක්‍රිය, 65%) සඳහා නැවත ලබා දී පසුව නැවත 25,000 xg, 4 ° C. තුළ කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. විනාඩි 30අධි ප්‍රවනතාවය Ni-NTA තීරුවකට පටවා, 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8 සමඟ සෝදා, අවසානයේ ප්‍රෝටීනය 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8 සමඟ ඉවත් කරන ලදී. NT2RepCT ජනනය කිරීමට සහ NTCT, thrombin ජීර්ණය ඔහුගේ සහ NT අතර අඩවිය (ThrCleav) හඳුන්වා දෙයි.ඔහුගේ-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep නිෂ්පාදනය කරයි), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT නිපදවයි), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (CT නිෂ්පාදනය කරයි), His-Thioredoxin-ThrCleav-හිද Thrombin cleavage sites පවතී. .* (NT* නිෂ්පාදනය කරයි), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R නිෂ්පාදනය කරයි), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp නිෂ්පාදනය කරයි), සහ His-සල්ෆර් රෙඩොක්සින්-ThrCleav-NTMiSp (නිෂ්පාදනය කරයි).නිර්මිතයන් thrombin (1:1000) සමඟ දිරවන ලද අතර 6-8 kDa අණුක බර එළිපත්තක් සහිත වර්ණාවලි/Por ඩයලිසිස් පටලයක් භාවිතා කරමින් 20 mM Tris-HCl, pH 8 සමඟ 4 ° C දී එක රැයකින් ඩයල් කරන ලදී.ඩයලිසිස් කිරීමෙන් පසු, ද්‍රාවණය Ni-NTA තීරුවකට පටවනු ලබන අතර උනන්දුවක් දක්වන ප්‍රෝටීන් අඩංගු අපජලය එකතු කරනු ලැබේ.නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලය අනුව බ්‍රැඩ්ෆෝර්ඩ් විශ්ලේෂණය භාවිතා කරන ලද NTF1Sp හැර, එක් එක් ප්‍රෝටීන වල වඳවීමේ සංගුණකය භාවිතා කරමින් 280 nm දී UV අවශෝෂණය මැනීම මගින් ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණය තීරණය කරන ලදී.සංශුද්ධතාවය SDS polyacrylamide (4-20%) ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් සහ Coomassie දීප්තිමත් නිල් පැහැති පැල්ලම් මගින් තීරණය කරන ලදී.මිනිත්තු 20 ක චක්‍රයකින් 10 kDa අණුක බර කඩඉමක් සහිත 4000 xg හි කේන්ද්‍රාපසාරී පෙරහන් (VivaSpin 20, GE Healthcare) භාවිතයෙන් ප්‍රෝටීන සාන්ද්‍රණය කරන ලදී.
ප්‍රෝටීන් ද්‍රාවණය දියකර 150 µl ප්‍රවේශමෙන් මිලිලීටර් 1ක පැහැදිලි ප්‍රාග්ධන කුප්පියකට (8 x 40 මි.මී. තාප විද්‍යාත්මක) නලයක් දමන්න.වාෂ්ප වීම වැළැක්වීම සඳහා නල ආවරණය කර පැරෆිල්ම් වලින් මුද්‍රා තබා ඇත.සාම්පල (n = 3) 37 ° C හෝ 60 ° C දී පුර්වීකරණය කරන ලද අතර, ජෙලේෂන් නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා වරින් වර පෙරළන ලදී.ජෙල් නොකළ සාම්පල අවම වශයෙන් සතියක්වත් ඉන්කියුබේට් කර ඇත.10 µM ප්‍රෝටීනයකට 10 mM DTT සහිත NTMiSp ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන අඩු කරන්න.ස්වාභාවික මකුළු සේද ආලේපනවල ජෙලේෂන් විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා, ස්වීඩන් පාලම් මකුළුවා කපා, ප්‍රධාන ඇම්ප්ලේටඩ් ග්‍රන්ථි දෙක 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 හි 200 μl තුළ තබා ඇති අතර ආලේපනය ග්‍රන්ථි වලින් වෙන් වීමට ඉඩ සලසන ලෙස කපා ඇත..ග්‍රන්ථිවල අඩංගු ද්‍රව්‍ය බෆරයේ දිය කර ඇත, වියළි බර නිර්ණය කිරීම සඳහා 50 µl (විවෘත කුප්පි 60 °C දී නිරන්තර බර දක්වා පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීම මගින්) සහ 37 °C දී ජෙලේෂන් සඳහා 150 µl.
මිනුම් ජ්‍යාමිතිය/මෙවලම සෑදී ඇත්තේ 20 mm ඉහළ විෂ්කම්භයක් සහ 0.5 mm පරතරයක් සහිත සමාන්තර තහඩුවක් භාවිතයෙන් මල නොබැඳෙන වානේ වලින්ය.නියැදිය 25 °C සිට 45 °C දක්වා සහ නැවත 25 °C දක්වා විනාඩියකට 1 °C අනුපාතයකින් මල නොබැඳෙන වානේ පතුළ පෙල්ටියර් තහඩුවක් භාවිතයෙන් රත් කරන්න.කම්පන මිනුම් 0.1 Hz සංඛ්යාතයකින් සහ ද්රව්යයේ රේඛීය viscoelastic කලාපයේ 100 mg / mL සහ 300-500 mg / mL සාම්පල සඳහා පිළිවෙලින් 5% සහ 0.5% ආතතියකින් සිදු කරන ලදී.වාෂ්පීකරණය වැළැක්වීම සඳහා අභිරුචි ආර්ද්රතා කුටියක් භාවිතා කරන්න.Prism 9 භාවිතයෙන් දත්ත විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
800 සිට 3900 cm–1 දක්වා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී අධෝරක්ත (IR) වර්ණාවලි එකතු කිරීම සඳහා.ATR උපාංගය මෙන්ම වර්ණාවලීක්ෂය හරහා ආලෝක මාර්ගයද, අත්හදා බැලීමට පෙර සහ අතරතුර වියළි පෙරන ලද වාතය සමඟ පිරිසිදු කර ඇත.ද්‍රාවණ (වර්ණාවලිවල ජල අවශෝෂණ උච්ච අවම කිරීම සඳහා 500 mg/mL) ස්ඵටික මතට පයිප්ප යොදන ලද අතර, මැනීමට පෙර ජෙල් (500 mg/mL) සෑදී පසුව ස්ඵටික වෙත මාරු කරන ලදී (n = 3).2 cm-1 විභේදනයකින් සහ 2 හි ශුන්‍ය රාජකාරි චක්‍රයකින් ස්කෑන් 1000ක් වාර්තා කරන ලදී. දෙවන ව්‍යුත්පන්නය ලකුණු නවයක සුමට පරාසයක් භාවිතා කරමින් OPUS (Bruker) භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලදී.F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software" භාවිතයෙන් වර්ණාවලිය 1720 සහ 1580 cm-1 අතර එකම ඒකාබද්ධ කලාපයට සාමාන්‍යකරණය කරන ලදී.ATR-IR වර්ණාවලීක්ෂය තුළ, අධෝරක්ත කදම්භයක නියැදියක විනිවිද යාමේ ගැඹුර තරංග සංඛ්‍යා මත රඳා පවතින අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ඉහළ තරංග සංඛ්‍යාවලට වඩා අඩු තරංග සංඛ්‍යා වලදී ශක්තිමත් අවශෝෂණයක් ඇති වේ.රූපයේ දැක්වෙන වර්ණාවලිය සඳහා මෙම බලපෑම් නිවැරදි කර නොමැත.3 ඒවා ඉතා කුඩා බැවින් (පරිපූරක රූපය 4).මෙම අගය සඳහා නිවැරදි කළ වර්ණාවලි Bruker OPUS මෘදුකාංගය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලදී.
ප්‍රතිපත්තිමය වශයෙන්, ඇමයිඩ් I උච්චය තුළ ඇති සංරචක විශ්වාසදායක ලෙස විසංයෝජනය කිරීමෙන් පසු ප්‍රෝටීන් අනුකූලතා පිළිබඳ පුළුල් ප්‍රමාණකරණයක් කළ හැකිය.කෙසේ වෙතත්, ප්රායෝගිකව යම් යම් බාධා ඇති වේ.විසංයෝජනය අතරතුර වර්ණාවලියේ ශබ්දය (අසත්‍ය) උච්ච ලෙස දිස්විය හැක.මීට අමතරව, ජලය නැමීම නිසා ඇති වන උච්චය ඇමයිඩ් I උච්චයේ පිහිටීම සමඟ සමපාත වන අතර මෙහි අධ්‍යයනය කරන ලද ජලීය ජෙල් වැනි විශාල ජල ප්‍රමාණයක් අඩංගු සාම්පල සඳහා සමාන විශාලත්වයක් තිබිය හැකිය.එබැවින්, අපි ඇමයිඩ් I උච්චය සම්පූර්ණයෙන්ම වියෝජනය කිරීමට උත්සාහ නොකළ අතර, අපගේ නිරීක්ෂණ සලකා බැලිය යුත්තේ NMR වර්ණාවලීක්ෂය වැනි වෙනත් ක්‍රම සඳහා සහාය දැක්වීම සඳහා පමණි.
50 mg/ml NT සහ His-NT2RepCT ද්‍රාවණ එක රැයකින් 37°C දී ජෙල් කරන ලදී.ඉන්පසු හයිඩ්‍රොජෙල් 20 mM Tris-HCl (pH 8) සමඟ 12.5 mg/ml සාන්ද්‍රණයකට තනුක කර, හොඳින් සොලවා ජෙල් බිඳීමට පයිප්ප යොදන ලදී.මීලඟට, හයිඩ්‍රොජෙල් 20 mM Tris-HCl (pH 8) සමඟ 10 වතාවක් තනුක කර, නියැදියේ 5 μl ෆෝම්වර් ආලේප කරන ලද තඹ ජාලයකට යොදන ලද අතර අතිරික්ත නියැදිය බ්ලොටින් කඩදාසිවලින් ඉවත් කරන ලදී.සාම්පල MilliQ වතුර 5 µl සමඟ දෙවරක් සෝදා 1% යුරේනයිල් ෆෝමේට් සමඟ මිනිත්තු 5 ක් පැල්ලම් කර ඇත.අවශෝෂක කඩදාසි සමඟ අතිරික්ත පැල්ලම් ඉවත් කරන්න, පසුව දැල වාතය වියළන්න.100 kV දී ක්‍රියාත්මක වන FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN භාවිතයෙන් මෙම ජාලක මත රූපගත කිරීම සිදු කරන ලදී.Veleta 2k × 2k CCD කැමරාවක් (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany) භාවිතයෙන් පින්තූර x 26,500 සහ x 43,000 විශාලනයකින් පටිගත කර ඇත.එක් එක් නියැදිය සඳහා (n = 1), රූප 10-15 වාර්තා කර ඇත.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) රූප විශ්ලේෂණය සහ තන්තු විෂ්කම්භය මැනීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී (n = 100, විවිධ තන්තු).Prism 9 යුගල නොකළ t-පරීක්ෂණ සිදු කිරීමට භාවිතා කරන ලදී (ද්වි-වලිග සහිත).මධ්යන්ය His-NT2RepCT සහ NT fibrils පිළිවෙළින් 11.43 (SD 2.035) සහ 7.67 (SD 1.389) nm වේ.විශ්වාසනීය පරතරය (95%) -4.246 සිට -3.275 දක්වා වේ.නිදහසේ අංශක = 198, p <0.0001.
10 µM thioflavin T (ThT) අඩංගු ද්‍රව සාම්පල 80 µl ස්ථිතික තත්ව යටතේ ත්‍රිත්ව (n = 3) වලින් මනිනු ලැබුවේ Corning 96-ළිං කළු පතුළ පැහැදිලි පහළ තහඩු (Corning Glass 3881, USA) භාවිතා කරමිනි.440 nm උත්තේජක පෙරහන සහ 480 nm විමෝචන පෙරහන (BMG Labtech, Offenburg, Germany වෙතින් FLUOStar Galaxy) භාවිතයෙන් ප්‍රතිදීප්ත වෙනස්කම් සටහන් කර ඇත.සංඥා තීව්‍රතාවය වෙනස් නොකර ThT හි විවිධ සාන්ද්‍රණයන් සමඟ අත්හදා බැලීම් සිදු කරන ලද බැවින්, ThT සංඥාව සංතෘප්ත හෝ නිවාදැමුවේ නැත.මීදුම මැනීම සඳහා 360 nm හි වාර්තාගත අවශෝෂණය.බීජ වැපිරීමේ අත්හදා බැලීම් සඳහා, 100 mg/mL ජෙල් 37 ° C. දී සාදන ලදී, නැවත සකස් කර, 5%, 10% සහ 20% යන මවුල අනුපාත යටතේ බීජ වැපිරීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී.Prism 9 භාවිතයෙන් දත්ත විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
His-NT2RepCT සහ NT>100 mg/mL තොග අයිස් මත දියකර 0.22 µm පෙරහනක් හරහා පෙරීම.නැනෝඩ්‍රොප් භාවිතයෙන් 280 nm හි අවශෝෂණය මැනීම මගින් සාන්ද්‍රණය ගණනය කරන ලදී.පැහැදිලි පතුලක් සහිත ළිං 96 ක කළු බන්ධන නොවන තහඩුවක (Corning) ළිංවල, සාම්පල 20 mM Tris-HCl pH 8 හි 20 mg/ml දක්වා තනුක කර 5 μM ThT (අවසාන සාන්ද්‍රණය) සමඟ මිශ්‍ර කර ඇත. 50 μl පරිමාව.සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද ආලෝක නාලිකාව සහ ThT රූපකරණය සඳහා FITC උද්දීපනය සහ විමෝචන පෙරහන් කට්ටල සහිත CellObserver (Zeiss) අන්වීක්ෂයකින් 37 °C දී සෑම මිනිත්තු 10 කට වරක් සාම්පල රූපගත කරන ලදී.රූපගත කිරීම සඳහා 20x/0.4 කාචයක් භාවිතා වේ.රූප විශ්ලේෂණය සඳහා Zen Blue (Zeiss) සහ ImageJ (https://imagej.nih.gov/) භාවිතා කරන ලදී.20 mM Tris pH 8 සහ 5 µM ThT අඩංගු 50 mg/mL සාන්ද්‍රණයකින් NT සහ His-NT2RepCT ද්‍රාවණවලින් ද ජෙල් සකස් කර විනාඩි 90ක් සඳහා 37°C ට ඉන්කිබියුට් කරන ලදී.බන්ධනය නොවන කළු 96 හොඳින් පැහැදිලි පහළ තහඩුවක 20 mM Tris, pH 8 සහ 5 μM ThT අඩංගු නව ළිඳකට ජෙල් කැබලි මාරු කරන ලදී.20x/0.4 විශාලනයකදී හරිත ප්‍රතිදීප්ත සහ දීප්තිමත් ක්ෂේත්‍ර රූප ලබා ගන්න.ImageJ රූප විශ්ලේෂණය සඳහා භාවිතා කරන ලදී.
විසඳුම NMR වර්ණාවලි QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) සහිත 600 MHz Bruker Avance Neo වර්ණාවලීක්ෂයක් මත 310 K දී ලබා ගන්නා ලදී.20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) 13C, 15N සමඟ ලේබල් කරන ලද 10 mg/mL සමජාතීය ප්‍රෝටීන් අඩංගු NMR සාම්පල .15N-HSQC හි 2D වර්ණාවලියේ උපරිම 23 පැවරීම සඳහා pH 6.7 හි NT2RepCT හි රසායනික මාරුවීම් භාවිතා කරන ලදී.
3.2 mm 13C/15N{1H} ඉලෙක්ට්‍රෝන රහිත පරීක්‍ෂණයකින් සමන්විත Bruker Avance III HD වර්ණාවලීක්ෂයක 800 MHz හි 13C, 15N-ලේබල් කරන ලද හයිඩ්‍රොජෙල්වල මැජික් කෝණ කැරකෙන ඝන NMR (MAS) වර්ණාවලි පටිගත කරන ලදී.නියැදි උෂ්ණත්වය 277 K හි විචල්‍ය උෂ්ණත්ව වායු ප්‍රවාහයක් භාවිතයෙන් පාලනය කරන ලදී. ද්විමාන ඩයිපෝල් භ්‍රමණ අනුනාද (DARR)76 සහ රේඩියෝ සංඛ්‍යාත නැවත සම්බන්ධ කිරීම (RFDR)77 වර්ණාවලි පිළිවෙලින් 12.5 kHz සහ 20 kHz MAS සංඛ්‍යාතවලින් ලබා ගන්නා ලදී.1H සිට 13C දක්වා හරස් ධ්‍රැවීකරණය (CP) 60.0 සිට 48.0 kHz දක්වා රේඛීය බෑවුමක් භාවිතා කරමින් 1H, 61.3/71.6 kHz 13C (12.5/20 kHz MAS) සහ සම්බන්ධතා කාලය 0.5-1 ms.දත්ත රැස් කිරීමේදී 73.5 kHz හි Spinal6478 විසංයෝජනය භාවිතා කරන ලදී.අත්පත් කර ගැනීමේ කාලය මිලි තත්පර 10 ක් වූ අතර චක්‍ර ප්‍රමාදය තත්පර 2.5 කි.RFDR වර්ණාවලියේ නිරීක්ෂණය කරන ලද තනි-සම්බන්ධිත Cα/Cβ සහසම්බන්ධතා DARR වර්ණාවලියේ ඇති ලාක්ෂණික අවශේෂ ආකාරයේ රසායනික මාරුවීම් සහ ගුණ-සම්බන්ධිත සහසම්බන්ධතා මත පදනම්ව පවරා ඇත.
Zipper79 දත්ත සමුදාය (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp, සහ NTMiSp සඳහා flutter ප්‍රවණතා සහ Rosetta ශක්තිය ඇගයීමට භාවිතා කරන ලදී.Zipper දත්ත සමුදාය Rosetta Energy80 ගණනය කරයි, එය ප්‍රෝටීන් ව්‍යුහය ආදර්ශනය කිරීමට සහ විශ්ලේෂණය කිරීමට නිදහස් බලශක්ති ක්‍රියාකාරකම් කිහිපයක් ඒකාබද්ධ කරයි.ශක්ති මට්ටම -23 kcal/mol හෝ ඊට අඩු අගයක් ෆයිබ්‍රිලේට් කිරීමට ඉහළ ප්‍රවණතාවක් පෙන්නුම් කරයි.අඩු ශක්තිය යනු සිපර් අනුකූලතාවයේ β-කෙඳි දෙකේ වැඩි ස්ථායීතාවයකි.මීට අමතරව, NT, NTFlSp සහ NTMiSp Ref හි ඇමයිලොයිඩොජනික් කලාප පුරෝකථනය කිරීමට Waltz ඇල්ගොරිතම භාවිතා කරන ලදී.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT ප්‍රෝටීන් ද්‍රාවණය pH අගය 6 සහ 7 දක්වා pH අගය අඩු කිරීම සඳහා pH 5.5 සහ 6.0 හි 2-(N-morpholino)එතනෙසල්ෆොනික් අම්ලය (MES) බෆරය සමඟ මිශ්‍ර කර ඇත.අවසාන ප්රෝටීන් සාන්ද්රණය 100 mg / ml වේ.
සෙන්ටිමීටර 0.1 ක දෘශ්‍ය මාර්ගයක් සහිත 300 μL cuvette භාවිතා කරමින් J-1500 CD වර්ණාවලීක්ෂයක් (JASCO, USA) මත මිනුම් සිදු කරන ලදී.ප්‍රෝටීන 20 mM පොස්පේට් බෆරයේ (pH 8) 10 μM (n = 1) දක්වා තනුක කර ඇත.ලුණු ඉදිරියේ ප්‍රෝටීන් ස්ථායීතාවය විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා, ප්‍රෝටීන පිළිවෙලින් 154 mM NaF හෝ NaCl අඩංගු 20 mM පොස්පේට් බෆරයේ (pH 8) එකම සාන්ද්‍රණයකින් (n = 1) විශ්ලේෂණය කරන ලදී.උෂ්ණත්ව ස්කෑන් 25 ° C සිට 95 ° C දක්වා 222 nm දී 1 ° C / min තාපන වේගයකින් වාර්තා විය.ස්වදේශිකව නැමුණු ප්‍රෝටීන වල අනුපාතය (KDmeasure - KDfinal)/(KDstart - KDfinal) සූත්‍රය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලදී.මීට අමතරව, එක් එක් නියැදිය සඳහා වර්ණාවලි පහක් 260 nm සිට 190 nm දක්වා 25 ° C සහ 95 ° C දක්වා උනුසුම් කිරීමෙන් පසු වාර්තා කරන ලදී.වර්ණාවලි පහක් සාමාන්‍යකරණය කර සුමට කර මවුල ඉලිප්සාකාරය බවට පරිවර්තනය කරන ලදී.Prism 9 භාවිතයෙන් දත්ත විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) හි ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය ස්ථිතික තත්ත්ව යටතේ කළු පාරදෘශ්‍ය පතුලක් සහිත (Corning Glass 3881, USA) ළිං 96 කින් යුත් කෝනිං තහඩු වල තුන් ගුණයකින් (n = 3) මනිනු ලැබේ.395 nm උද්දීපන තරංග ආයාමයක් සහිත ප්‍රතිදීප්ත පාදක තහඩු කියවනයකින් සාම්පල මනින්න සහ විමෝචනය 509 nm හි ජෙලේෂන් කිරීමට පෙර සහ පැය 2 කට පසුව 37 ° C දී වාර්තා කරන්න.Prism 9 සමඟ දත්ත විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
Purine nucleoside phosphorylase ක්‍රියාකාරකම් තක්සේරු කට්ටලය (fluorometric method, Sigma Aldrich) නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව භාවිතා කරන ලදී.ඔහුගේ-NT-PNP අඩංගු ජෙල් සහ ද්‍රාවණවල ක්‍රියාකාරකම් මැනීමට, ඔහුගේ-NT-PNP 10 ng 100 mg/mL NT සමඟ මිශ්‍ර කර මුළු පරිමාව 2 µL වෙත මිශ්‍ර කරන්න, මන්ද ජෙල් කට්ටලයේ හඳුනාගැනීමේ පරතරයට ඉහළින් සංඥාවක් ලබා දුන්නේය.ඔහුගේ-NT-PNP නොමැතිව ජෙල් සහ විසඳුම් සඳහා පාලන ඇතුළත් විය.මිනුම් දෙවරක් සිදු කරන ලදී (n = 2).ක්‍රියාකාරකම් මැනීමෙන් පසුව, ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණය ඉවත් කර මැනීමේදී ජෙල් නොවෙනස්ව පවතින බව සහතික කිරීම සඳහා ජෙල් ඡායාරූපගත කරන ලදී.Prism 9 භාවිතයෙන් දත්ත විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
අධ්‍යයන සැලසුම් පිළිබඳ වැඩි විස්තර සඳහා, මෙම ලිපියට සම්බන්ධ කර ඇති Nature අධ්‍යයනය සාරාංශය බලන්න.
රූප 1 සහ 2 මූලික දත්ත ඉදිරිපත් කරයි.1c, 2a-c, 3a, b, e-g, 4, 5b, d, f, සහ 6, පරිපූරක රූප.3, පරිපූරක අත්තික්කා.5a, d, පරිපූරක fig.6 සහ පරිපූරක අත්තික්කා.8. මෙම අධ්‍යයනයේ දත්ත දත්ත Zenodo දත්ත සමුදාය https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 හි සත්කාරකත්වය දරයි.මෙම අධ්‍යයනයෙන් ලබාගත් NMR දත්ත BMRBig36 ප්‍රවේශ හැඳුනුම යටතේ BMRBig ගබඩාවට පළ කරන ලදී.GFP සහ PNP හි ව්‍යුහයන් PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) වෙතින් ලබාගෙන ඇත.
රයිසින්, ඒ. සහ ජොහැන්සන්, ජේ. කරකැවෙන කෘතිම මකුළු සේද.ජාතික රසායනික.ජීව විද්යාව.11, 309-315 (2015).
බබ්, පීඑල් සහ අල්.Nephila clavipes ජෙනෝමය මකුළු සේද ජානවල විවිධත්වය සහ ඒවායේ සංකීර්ණ ප්‍රකාශනය ඉස්මතු කරයි.ජාතික ජෙනට්.49, 895-903 (2017).