347 12.7*1.24mm මල නොබැඳෙන වානේ දඟර සහිත නල, සමමුහුර්ත විද්‍යුත් ස්ථිතික ඝනීභවනයේ අණුක යාන්ත්‍රණය සහ α-synuclein සහ tau එකතු කිරීම

Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ සීමිත CSS සහය ඇති බ්‍රවුසර අනුවාදයක් භාවිතා කරයි.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන කළ බ්‍රවුසරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා ප්‍රකාරය අක්‍රිය කරන්න).ඊට අමතරව, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාසිතා සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය පෙන්වමු.
එක් ස්ලයිඩයකට ලිපි තුනක් පෙන්වන ස්ලයිඩර්.ස්ලයිඩ හරහා ගමන් කිරීමට පසුපස සහ ඊළඟ බොත්තම් භාවිතා කරන්න, එක් එක් විනිවිදක හරහා ගමන් කිරීමට අවසානයේ ඇති ස්ලයිඩ පාලක බොත්තම් භාවිතා කරන්න.

347 මල නොබැඳෙන වානේ පයිප්ප පිරිවිතර

347 12.7*1.24mm මල නොබැඳෙන වානේ දඟර නල

පිටත විෂ්කම්භය: 6.00 mm OD සිට 914.4 mm OD දක්වා, ප්‍රමාණ 24” NB දක්වා ඇත Ex-stock, OD ප්‍රමාණයේ වානේ ටියුබ් ලබා ගත හැකිය Ex-stock

SS 347 පයිප්ප ඝණකම පරාසය: 0.3mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ආදිය (0.5-12mm) හෝ අවශ්‍ය පරිදි සකස් කළ යුතු සාමාන්‍ය නොවන ප්‍රමාණය

වර්ගය: SS 347 මැහුම් රහිත පයිප්ප |SS 347 ERW පයිප්ප |SS 347 වෑල්ඩින් පයිප්ප |SS 347 Fabricated Pipes |SS 347 CDW ටියුබ්, LSAW පයිප්ප / මැහුම් වෑල්ඩින් / නැවත ඇඳීම

පෝරමය: එස්එස් 347 රවුම් පයිප්ප/ ටියුබ්, එස්එස් 347 හතරැස් පයිප්ප/ ටියුබ්, එස්එස් 347 සෘජුකෝණාස්රාකාර පයිප්ප/ ටියුබ්, එස්එස් 347 කොයිල්ඩ් ටියුබ්, එස්එස් 347 “යූ” හැඩය, එස්එස් 347 පෑන් කේක් කොයිල්, හයිද්‍රා එස්එස් 347

දිග: තනි අහඹු, ද්විත්ව අහඹු සහ අවශ්‍ය දිග අවසානය: සරල කෙළවර, බෙල්ඩ් කෙළවර, පාගා දැමූ

අවසාන ආරක්ෂණය: ප්ලාස්ටික් ආවරණ |පිටත නිමාව: 2B, No.4, No.1, No.8 මල නොබැඳෙන වානේ පයිප්ප සඳහා දර්පණ නිමාව, පාරිභෝගික අවශ්‍යතා අනුව අවසන් කරන්න

බෙදා හැරීමේ කොන්දේසිය: ඇනීල් සහ අච්චාරු දමන ලද, ඔප දැමූ, දීප්තිමත් ඇනෙල්ඩ්, සීතල අඳින ලද

පරීක්ෂණ, පරීක්ෂණ වාර්තා: මෝල් පරීක්ෂණ සහතික, EN 10204 3.1, රසායනික වාර්තා, යාන්ත්‍රික වාර්තා, PMI පරීක්ෂණ වාර්තා, දෘශ්‍ය පරීක්ෂණ වාර්තා, තෙවන පාර්ශ්ව පරීක්ෂණ වාර්තා, NABL අනුමත රසායනාගාර වාර්තා, විනාශකාරී පරීක්ෂණ වාර්තාව, විනාශකාරී පරීක්ෂණ වාර්තා නොවන වාර්තා

ඇසුරුම් කිරීම: ලී පෙට්ටි, ප්ලාස්ටික් බෑග්, වානේ තීරු බණ්ඩල්, හෝ පාරිභෝගික ඉල්ලීම් අනුව ඇසුරුම් කර ඇත

විශේෂ: ඉහත හැර අනෙකුත් ප්‍රමාණ සහ පිරිවිතර ඉල්ලීම මත නිෂ්පාදනය කළ හැක

SS 347 පයිප්ප ප්‍රමාණය පරාසය: අඟල් 1/2 NB, OD සිට අඟල් 24 දක්වා

ASTM A312 347: අධික උෂ්ණත්වය සහ සාමාන්‍ය විඛාදන සේවය සඳහා අදහස් කරන ලද බාධාවකින් තොරව සහ සෘජු මැහුම් වෑල්ඩින් ඔස්ටෙනිටික් පයිප්ප.වෙල්ඩින් කිරීමේදී පිරවුම් ලෝහයට අවසර නැත.

ASTM A358 347: විඛාදන සහ/හෝ ඉහළ උෂ්ණත්ව සේවාව සඳහා විදුලි විලයන වෑල්ඩින් ඔස්ටෙනිටික් පයිප්ප.සාමාන්යයෙන් මෙම පිරිවිතරයට අනුව නිෂ්පාදනය කරනු ලබන්නේ අඟල් 8 දක්වා පයිප්ප පමණි.වෙල්ඩින් අතරතුර පිරවුම් ලෝහ එකතු කිරීම අවසර දෙනු ලැබේ.

ASTM A790 347: ආතති විඛාදන ඉරිතැලීම් වලට ප්‍රතිරෝධය කෙරෙහි විශේෂ අවධානයක් යොමු කරමින්, සාමාන්‍ය විඛාදන සේවාව සඳහා අදහස් කරන ලද බාධාවකින් තොරව සහ සෘජු-මැහුම් වෑල්ඩින් කරන ලද ෆෙරිටික් / ඔස්ටෙනිටික් (ද්විත්ව) පයිප්ප.

ASTM A409 347: සෘජු-මැහුම් හෝ සර්පිලාකාර-මැහුම් විද්‍යුත් විලයනය 14” සිට 30” දක්වා ප්‍රමාණයේ විශාල විෂ්කම්භයකින් යුත් ඔස්ටෙනිටික් ආලෝක බිත්ති පයිප්පයක් Sch5S සහ Sch 10S බිත්ති සහිත විඛාදන සහ/හෝ ඉහළ

ASTM A376 347: ඉහළ උෂ්ණත්ව යෙදීම් සඳහා බාධාවකින් තොර ඔස්ටෙනිටික් පයිප්ප.

ASTM A813 347: ඉහළ උෂ්ණත්වය සහ සාමාන්‍ය විඛාදන යෙදුම් සඳහා තනි මැහුම්, තනි හෝ ද්විත්ව වෑල්ඩින් ඔස්ටෙනිටික් පයිප්ප.

ASTM A814 347: අධික උෂ්ණත්වය සහ සාමාන්‍ය විඛාදන සේවාව සඳහා සීතල-වැල්ඩින් කරන ලද ඔස්ටෙනිටික් පයිප්ප.

347H මල නොබැඳෙන වානේ පයිප්ප රසායනික සංයුතිය

මල නොබැඳෙන වානේ 347H පයිප්ප යාන්ත්රික ගුණ

මල නොබැඳෙන වානේ 347H පයිප්ප භෞතික ගුණාංග

347H මල නොබැඳෙන වානේ පයිප්ප සඳහා සමාන ශ්‍රේණි

Amyloid alpha-synuclein (αS) එකතු කිරීම පාකින්සන් රෝගය සහ අනෙකුත් synucleinopathies වල ලක්ෂණයකි.මෑතකදී, ඇල්සයිමර් රෝගය සමඟ බහුලව සම්බන්ධ වන ටෝ ප්‍රෝටීනය αS ව්‍යාධි විද්‍යාව සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති අතර αS පොහොසත් ඇතුළත් කිරීම් තුළ සම-දේශීයකරණය වී ඇති බව සොයාගෙන ඇත, නමුත් ප්‍රෝටීන දෙකේ කැටි ගැසීමේ අණුක යාන්ත්‍රණය අපැහැදිලිව පවතී.Tau වැනි ධන ආරෝපිත පොලිපෙප්ටයිඩ සහිත විද්‍යුත් ස්ථිතික සංකීර්ණ ඝනීභවනය හරහා αS අදියර ද්‍රව ඝනීභවනයට වෙන් වන බව අපි මෙහි වාර්තා කරමු.පොලිකේෂන් සඳහා αS හි ඇති සම්බන්ධය සහ කැටි ගැසීම් ජාලයේ සංයුජතා ක්ෂය වීමේ අනුපාතය මත පදනම්ව, කැටි ගැසීම් වේගවත් ජෙලේෂණයට හෝ සමෝධානයකට භාජනය වන අතර පසුව මන්දගාමී ඇමයිලොයිඩ් එකතු කරයි.උසස් ජෛව භෞතික ශිල්පීය ක්‍රම මාලාවක් ඒකාබද්ධ කිරීමෙන්, ද්‍රව-ද්‍රව αS/Tau අදියර වෙන් කිරීම සංලක්ෂිත කිරීමට සහ ද්‍රව ප්‍රෝටීන් ඝනීභවනයක ප්‍රෝටීන දෙකම අඩංගු විෂමජාතීය සමස්ථයන් සෑදීමට තුඩු දෙන ප්‍රධාන සාධක හඳුනා ගැනීමට අපට හැකි විය.
පටල මැදිරි වලට අමතරව, ද්‍රව-ද්‍රව අවධි වෙන් කිරීම (LLPS) ලෙස හැඳින්වෙන ක්‍රියාවලියක් හරහා ජෛව අණුක ඝනීභවනය හෝ ජල බිඳිති ලෙස හැඳින්වෙන ප්‍රෝටීන්-පොහොසත්, ද්‍රව-සමාන ඝන ශරීර සෑදීමෙන් සෛල තුළ අවකාශීය වෙන්වීම ද ලබා ගත හැකිය.මෙම ජල බිඳිති සාමාන්‍යයෙන් ප්‍රෝටීන හෝ ප්‍රෝටීන සහ RNA අතර බහු සංයුජ තාවකාලික අන්තර්ක්‍රියා මගින් සෑදී ඇති අතර සියලුම ජීව පද්ධතිවල පාහේ විවිධ කාර්යයන් ඉටු කරයි.LLP-හැකියාව ඇති ප්‍රෝටීන විශාල සංඛ්‍යාවක් ස්වභාවධර්මයේ සහ ජෛව අණුක ඝනීභවනය 3,4,5 සෑදීමේදී බෙහෙවින් අක්‍රමිකතා ඇති අඩු සංකීර්ණත්වයේ අනුපිළිවෙලවල් ප්‍රදර්ශනය කරයි.මෙම ද්‍රව-සමාන ඝනීභවනය සෑදෙන ප්‍රෝටීනවල නම්‍යශීලී, බොහෝ විට අක්‍රමිකතා සහ බහු සංයුජතා ස්වභාවය බොහෝ පර්යේෂණාත්මක අධ්‍යයනයන් මගින් හෙළිදරව් කර ඇත, නමුත් මෙම ඝනීභවනය වඩාත් ඝන ලෙස වර්ධනය වීම සහ පරිණත වීම පාලනය කරන විශේෂිත අණුක නිර්ණායක ගැන එතරම් දැනුමක් නැත. රජයේ..
විකෘති ප්‍රෝටීන්-ධාවනය කරන ලද LLPS සහ ජල බිඳිති ඝන ව්‍යුහයන් බවට පරිවර්තනය කිරීම බොහෝ විට පිරිහෙන රෝගවල ලක්ෂණ වන දිය නොවන විෂ සමුච්චයන් සෑදීමට තුඩු දෙන අදාළ සෛලීය මාර්ග විය හැකිය යන උපකල්පනයට නව දත්ත සහාය දක්වයි.බොහෝ LLPS ආශ්‍රිත ආවේණික ආබාධ සහිත ප්‍රෝටීන (IDPs), බොහෝ විට අධික ලෙස ආරෝපිත සහ නම්‍යශීලී, ඇමයිලොයිඩ් එකතු කිරීමේ ක්‍රියාවලිය හරහා ස්නායු පරිහානිය සමඟ දිගු කලක් සම්බන්ධ වී ඇත.විශේෂයෙන්ම, FUS7 හෝ TDP-438 වැනි ජෛව අණුක IDP ඝනීභවනය හෝ hnRNPA19 වැනි විශාල අඩු සංකීර්ණ වසම් සහිත ප්‍රෝටීන ද්‍රවීකරණය නම් ක්‍රියාවලියක් හරහා ජෙල් වැනි හෝ ඝන ආකාරවලට පවා වයස්ගත වන බව පෙන්වා දී ඇත.සංයෝගය.ඝන අවධි සංක්‍රාන්තියට (LSPT) කාලයෙහි ශ්‍රිතයක් ලෙස හෝ ඇතැම් පශ්චාත් පරිවර්තන වෙනස් කිරීම් හෝ ව්‍යාධි විද්‍යාත්මකව සැලකිය යුතු විකෘති වලට ප්‍රතිචාර වශයෙන්1,7.
vivo හි LLPS හා සම්බන්ධ තවත් IDP එකක් වන්නේ Tau, ක්ෂුද්‍ර නාල ආශ්‍රිත ආබාධිත ප්‍රෝටීනයක් වන අතර එහි ඇමයිලොයිඩ් සමුච්චය ඇල්සයිමර් රෝගයට සම්බන්ධ වී ඇති නමුත් මෑතකදී පාකින්සන් රෝගය (PD) සහ අනෙකුත් උපාගමික න්‍යෂ්ටික ප්‍රෝටීන් ප්‍රෝටීන් 11, 12, 13 සම්බන්ධ වේ.වාසිදායක විද්‍යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්‍රියා හේතුවෙන් Tau ද්‍රාවණය/සයිටොප්ලාස්මයෙන් ස්වයංසිද්ධව විඝටනය වන බව පෙන්වා දී ඇත.මෙම ආකාරයේ විශේෂිත නොවන අන්තර්ක්‍රියා ස්වභාවධර්මයේ බොහෝ ජෛව අණුක ඝනීභවනය පිටුපස ගාමක බලවේගය බව ද නිරීක්ෂණය කර ඇත15.tau ප්‍රෝටීනයක් සම්බන්ධයෙන් ගත් කල, විද්‍යුත් ස්ථිතික සමුච්චය සෑදිය හැක්කේ ප්‍රෝටීනයේ ප්‍රතිවිරුද්ධ ආරෝපිත ප්‍රදේශ බෙදීමේ ක්‍රියාවලිය අවුලුවාලීමෙන් හෝ RNA වැනි සෘණ ආරෝපිත බහුඅවයවික සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කිරීම හරහා සංකීර්ණ එකතු කිරීමෙනි.
මෑතදී, α-synuclein (αS), PD සහ අනෙකුත් ස්නායු විකෘතිතා රෝග සඳහා synucleinopathy17,18 ලෙසින් හැඳින්වෙන ඇමයිලොයිඩ් IDP, තරල වැනි හැසිරීම් සහිත ප්‍රෝටීන් ඝනීභවනයන්හි සංකේන්ද්‍රණය වූ සෛලීය සහ සත්ව ආකෘති19,20 තුළ ප්‍රදර්ශනය කර ඇත.මෙම ක්‍රියාවලියට සුවිශේෂී ලෙස ඉහළ ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණයන් සහ අසාමාන්‍ය ලෙස දිගු පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කාලයන් අවශ්‍ය වුවද, ප්‍රධාන වශයෙන් ජලභීතික අන්තර්ක්‍රියා හරහා සරල එකතු කිරීමකින් αS LLPS වලට භාජනය වන බව in vitro අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත.vivo හි නිරීක්ෂණය කරන ලද αS අඩංගු ඝනීභවනය මෙම හෝ වෙනත් LLPS ක්‍රියාවලි මගින් සෑදෙන්නේද යන්න ප්‍රධාන නොවිසඳුණු ගැටලුවක්ව පවතී.ඒ හා සමානව, PD සහ අනෙකුත් synucleinopathies හි නියුරෝන වල αS ඇමයිලොයිඩ් සමුච්චය නිරීක්ෂණය වී ඇතත්, αS අන්තර් සෛලීය ඇමයිලොයිඩ් සමුච්චනයට භාජනය වන නිශ්චිත යාන්ත්‍රණය අපැහැදිලි ය, මන්ද මෙම ප්‍රෝටීනයේ අධික ලෙස ප්‍රකාශ කිරීම මෙම ක්‍රියාවලියම ප්‍රබෝධමත් නොවන බව පෙනේ.අන්තර් සෛලීය αS ඇමයිලොයිඩ් එකලස්කිරීම් ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා ඇතැම් සෛලීය ස්ථාන හෝ ක්ෂුද්‍ර පරිසරයන් අවශ්‍ය බව යෝජනා කරමින් අමතර සෛලීය හානි බොහෝ විට අවශ්‍ය වේ.එක් සෛලීය පරිසරයක් විශේෂයෙන් සමුච්චය වීමට ඉඩ ඇත ප්රෝටීන් ඝනීභවනය 23 අභ්යන්තරය විය හැක.
සිත්ගන්නා කරුණ නම්, αS සහ tau පාකින්සන් රෝගය සහ අනෙකුත් synucleinopathies 24,25 ඇති මිනිසුන්ගේ ලාක්ෂණික රෝග ඇතුළත් කිරීම් වල සම-ප්‍රාදේශීයකරණය වී ඇති බව සොයාගෙන ඇති අතර 26,27 ප්‍රෝටීන දෙක අතර සමමුහුර්ත ව්‍යාධි සම්බන්ධතාවයක් වාර්තා කර ඇති අතර αS සහ αS අතර විභව සම්බන්ධතාවයක් යෝජනා කරයි. neurodegenerative රෝග වල tau.අසනීපය.αS සහ tau, vitro සහ vivo 28,29 තුළ එකිනෙකාගේ එකතුවීම අන්තර්ක්‍රියා කර ප්‍රවර්ධනය කරන බව සොයාගෙන ඇති අතර synucleinopathies 30 රෝගීන්ගේ මොළයේ මෙම ප්‍රෝටීන දෙකෙන් සමන්විත විෂම සමස්ථයන් නිරීක්ෂණය කර ඇත.කෙසේ වෙතත්, αS සහ tau අතර අන්තර්ක්‍රියාවේ අණුක පදනම සහ එහි සම-එකතු කිරීමේ යාන්ත්‍රණය ගැන දන්නේ අල්ප වශයෙනි.αS αS හි අධික සෘණ ආරෝපිත C-පර්යන්ත කලාපය සහ ධන ආරෝපිත අපද්‍රව්‍ය වලින් පොහොසත් වන tau හි මධ්‍යම ප්‍රෝලීන් බහුල කලාපය අතර විද්‍යුත් ස්ථිතික ආකර්ෂණයක් හරහා tau සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කරන බවට වාර්තා වී ඇත.
මෙම අධ්‍යයනයේ දී, අපි පෙන්වා දෙන්නේ, αS හට, බහු-L-ලයිසීන් (pLK) වැනි අනෙකුත් ධන ආරෝපිත පොලිපෙප්ටයිඩ සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කිරීමට ප්‍රතිවිරුද්ධව, සහ මෙම ක්‍රියාවලියේදී, tau ප්‍රෝටීන් හමුවේ විද්‍යුත් ස්ථිතික සංකීර්ණ ඝනීභවනය හරහා ජල බිඳිති බවට විඝටනය විය හැකි බවයි.αS ජල බිඳිති ජාලය සඳහා පලංචිය අණුවක් ලෙස ක්‍රියා කරයි.coacervate ජාලයට සම්බන්ධ ප්‍රෝටීන වල සංයුජතා සහ ප්‍රබලතාවයේ වෙනස්කම් සමඟ සම්බන්ධ වන විද්‍යුත් ස්ථිතික αS coacervates වල මේරීමේ ක්‍රියාවලියේ කැපී පෙනෙන වෙනස්කම් අපි හඳුනාගෙන ඇත.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, දිගුකාලීන ද්‍රව කෝසර්වේට් වල αS සහ tau ඇමයිලොයිඩ් ප්‍රෝටීන සම-එකතු කිරීම අපි නිරීක්ෂණය කළ අතර එවැනි කෝසර්වේට් වල මෙම ප්‍රෝටීන දෙක සම-එකතු කිරීමට තුඩු දෙන ප්‍රධාන සාධක කිහිපයක් හඳුනා ගත්තෙමු.මෙහිදී අපි මෙම ක්‍රියාවලිය සවිස්තරාත්මකව විස්තර කරන්නෙමු, එය රෝග-විශේෂිත ඇතුළත් කිරීම් වල ප්‍රෝටීන දෙකක් කොලොකලීස් කිරීමට යටින් පවතින අණුක යාන්ත්‍රණයකි.
αS හට මධ්‍යස්ථ pH අගයෙහි අධික ලෙස ඇනොනික් C-පර්යන්ත වලිගයක් ඇත (රූපය 1a), සහ අපි උපකල්පනය කළේ එය බහුඅවයවික අක්‍රමිකතා සහිත පොලිපෙප්ටයිඩ අණු සහිත විද්‍යුත් ස්ථිතික සංකීර්ණවල ඝනීභවනය හරහා LLPS වලට භාජනය විය හැකි බවයි.උදාසීන pH 32 හි ධන ආරෝපිත සහ අක්‍රමික බහු අවයවික ස්වභාවය හේතුවෙන් අපි ආරම්භක මාදිලි අණුව ලෙස අපි 100-අවශේෂ පොලි-L-ලයිසීන් (pLK) භාවිතා කළෙමු. පළමුව, විසඳුම NMR වර්ණාවලීක්ෂය හරහා pLK αS හි Ct වසම සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බව අපි තහවුරු කළෙමු. (රූපය 1b) වැඩිවන αS:pLK molar අනුපාත ඉදිරියේ 13C/15N-ලේබල් αS භාවිතා කිරීම.αS හි Ct-domain සමඟ pLK හි අන්තර්ක්‍රියා රසායනික මාරුවේ කැළඹීම් සහ ප්‍රෝටීනයේ මෙම කලාපයේ උච්ච තීව්‍රතාවයේ අඩු වීමක් පෙන්නුම් කරයි.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, අපි දළ වශයෙන් αS සාන්ද්‍රණයකින් pLK සමඟ αS මිශ්‍ර කළ විට.පොලිඑතිලීන් ග්ලයිකෝල් (5-15% PEG-8) ඉදිරියේ 5-25 µM (සාමාන්‍ය LLPS බෆරය: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) අපි වහාම ප්‍රෝටීන් සෑදීමේ පුළුල් ක්ෂේත්‍රයක් හරහා ගියෙමු. .ප්‍රතිදීප්ත (WF) සහ දීප්තිමත් ක්ෂේත්‍ර (BF) අන්වීක්ෂය (Fig. 1c) භාවිතයෙන් ජල බිඳිති නිරීක්ෂණය කරන ලදී.සාන්ද්‍රිත αS අඩංගු 1-5 µm බිංදු (1 µM AlexaFluor488-ලේබල් කරන ලද αS, AF488-αS එකතු කරන ලදි), ඒවායේ විද්‍යුත් ස්ථිතික ගුණාංග 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) දක්වා ප්‍රතිරෝධයෙන් සහ එහි NaCl සාන්ද්‍රණය වැඩි වීම (රූපය 1c).αS/pLK විද්‍යුත් ස්ථිතික සංකීර්ණයේ කෝසර්වේට් වල ද්‍රව-සමාන ස්වභාවය පෙන්නුම් කරන්නේ ඒවායේ මිලි තත්පර ඇතුළත විලයනය වීමේ හැකියාව මගිනි (රූපය 1d).turbidimetry භාවිතා කරමින්, අපි මෙම කොන්දේසි යටතේ ජල බිඳිති ගොඩනැගීමට ප්රමාණාත්මක, එහි ස්ථායීතාවය (පය. 1e) සම්බන්ධ ප්රධාන අන්තර්ක්රියාකාරිත්වයේ විද්යුත්ස්ථිතික ස්වභාවය තහවුරු කර, සහ LLPS ක්රියාවලිය මත විවිධ පොලිමර් අනුපාතවල බලපෑම ඇගයීමට ලක් කළා (රූපය 1f).බහු අවයවික අනුපාත පුළුල් පරාසයක් තුළ ජල බිඳිති සෑදීම නිරීක්ෂණය වුවද, pLK αS ට වඩා වැඩි වන විට ක්රියාවලිය ඉතා වාසිදායක වේ.LLPs රසායනිකව වෙනස් විස්ථාපන කාරකය dextran-70 (70 kDa) භාවිතයෙන් හෝ වීදුරු විනිවිදක බිංදු, විවිධ ද්‍රව්‍යවල ක්ෂුද්‍ර තහඩු ළිං, Eppendorf හෝ quartz කේශනාලිකා ඇතුළු විවිධ නියැදි ආකෘති භාවිතා කිරීම ද නිරීක්ෂණය කර ඇත.
මෙම අධ්‍යයනයේදී භාවිතා කරන ලද WT-αS සහ ΔCt-αS ප්‍රභේදවල විවිධ ප්‍රෝටීන් කලාපවල ක්‍රමානුකූල නිරූපණයකි.amphipathic N-terminal domain, hydrophobic amyloid-forming (NAC) කලාපය සහ සෘණ ආරෝපිත C-terminal domain පිළිවෙලින් නිල්, තැඹිලි සහ රතු පැහැයෙන් දැක්වේ.WT-αS හි ඉතිරිය සඳහා ශුද්ධ ගාස්තු (NCPR) සිතියම පෙන්වා ඇත.b macromolecular clumps නොමැති විට αS/pLK අන්තර්ක්‍රියාවේ NMR විශ්ලේෂණය.pLK සාන්ද්‍රණය වැඩි වන විට (αS:pLK මවුල අනුපාත 1:0.5, 1:1.5, සහ 1:10 පිළිවෙලින් ලා කොළ, කොළ සහ තද කොළ වලින් දැක්වේ).c Coacervate αS/pLK (molar අනුපාතය 1:10) 25 µM හි (1 µM AF488-ලේබල් කරන ලද αS හෝ WF රූප සඳහා Atto647N-ලේබල් කරන ලද pLK) LLPS බෆරයේ (ඉහළ) හෝ NaCl 500 ට පසු වමට % 1,6-හෙක්සැනඩියෝල් (1,6-HD; පහළ දකුණ).පරිමාණ තීරුව = 20 µm.d 25 μM සාන්ද්‍රණයකදී αS/pLK (molar අනුපාතය 1:10) හි BF බිංදු විලයනයෙහි නියෝජිත අන්වීක්ෂීය රූප;ඊතල වලින් දැක්වෙන්නේ තනි බිංදු (රතු සහ කහ ඊතල) නව බිංදුවක් (තැඹිලි ඊතලයක්) 200 ms තුළ ඒකාබද්ධ කිරීම) .පරිමාණ තීරුව = 20 µm.25 µM αS හි 500 mM NaCl හෝ 10% 1,6-HD එකතු කිරීමට පෙර සහ පසු LLPS බෆරයේ e ආලෝක විසිරීම (350 nm දී) αS/pLK එකතු කිරීම (N = 3 නියැදි අනුරූ, මධ්‍යන්‍ය සහ සම්මත අපගමනය ද පෙන්වා ඇත).f BF රූපය (ඉහළ) සහ ආලෝකය විසිරීම විශ්ලේෂණය (350 nm දී, පහළ) αS/pLK එකතුව 25 μM αS දී αS: pLK molar අනුපාතය වැඩි වීම (N = 3 නියැදි අනුරූ, මධ්යන්ය සහ සම්මත අපගමනය ද පෙන්වා ඇත).පරිමාණ තීරුව = 10 µm.එක් රූපයක් මත ඇති පරිමාණ තීරුව එක් පුවරුවක ඇති සියලුම රූපවල පරිමාණය දක්වයි.අමු දත්ත අමු දත්ත ගොනු ආකාරයෙන් සපයනු ලැබේ.
αS/pLK විද්‍යුත් ස්ථිතික සංකීර්ණ ඝනීභවනය සහ tau31 සමඟ සෘජු අන්තර්ක්‍රියා හරහා tau/RNA ඝනීභවනයේ සේවාදායක අණුවක් ලෙස αS හි පෙර නිරීක්ෂණ මත පදනම්ව, RNA නොමැති විට αS සහ tau ද්‍රාවකය සමඟ සම-වෙන් කළ හැකි බව අපි උපකල්පනය කළෙමු. ඝනීභවනය.විද්යුත්ස්ථිතික සංකීර්ණ හරහා, සහ αS යනු αS/Tau coacervates හි පලංචිය ප්‍රෝටීන් වේ (රූපය 2e හි tau ආරෝපණ ව්‍යාප්තිය බලන්න).10 μM αS සහ 10 μM Tau441 (පිළිවෙලින් 1 μM AF488-αS සහ 1 μM Atto647N-Tau අඩංගු) LLPS බෆරයේ එකට මිශ්‍ර වූ විට, ඒවා පහසුවෙන් ප්‍රෝටීන දෙකම අඩංගු ප්‍රෝටීන සමූහ සෑදෙන බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු.(රූපය 2a).බිංදු වල ඇති ප්‍රෝටීන දෙකේ කොලොකලීස් කිරීම confocal (CF) අන්වීක්ෂය මගින් තහවුරු කරන ලදී (පරිපූරක Fig. 1a).dextran-70 එකතු කිරීමේ කාරකයක් ලෙස භාවිතා කරන විට සමාන හැසිරීම් නිරීක්ෂණය කරන ලදී (පරිපූරක Fig. 1c).FITC-ලේබල් කරන ලද PEG හෝ dextran භාවිතා කරමින්, අපි සෙනඟ ගැවසෙන නියෝජිතයන් දෙකම සාම්පල හරහා ඒකාකාරව බෙදා හැර ඇති බව සොයා ගත්තෙමු, වෙන්වීමක් හෝ සම්බන්ධයක් නොපෙන්වයි (පරිපූරක Fig. 1d).ඒ වෙනුවට, එය යෝජනා කරන්නේ, අනෙකුත් LLP පද්ධති33,34 හි දක්නට ලැබෙන පරිදි, PEG වඩාත් ස්ථායී ජනාකීර්ණ නියෝජිතයෙකු වන බැවින්, මෙම ක්‍රමය තුළ ඔවුන් macromolecular crowding බලපෑම් හරහා අදියර වෙන් කිරීම ප්‍රවර්ධනය කරන බවයි.මෙම ප්‍රෝටීන් බහුල ජල බිඳිති NaCl (1 M) වෙත සංවේදී වූ නමුත් 1,6-HD (10% v/v) ට සංවේදී නොවූ අතර ඒවායේ විද්‍යුත් ස්ථිතික ගුණ තහවුරු කරයි (පරිපූරක Fig. 2a, b).BF අන්වීක්ෂය භාවිතයෙන් මිලි තත්පර ඒකාබද්ධ ජල බිඳිති සිදුවීම් නිරීක්ෂණය කිරීමෙන් ඔවුන්ගේ තරල හැසිරීම තහවුරු විය (රූපය 2b).
LLPS බෆරයේ αS/Tau441 coacervates වල Confocal (CF) අන්වීක්ෂ රූප (එක් එක් ප්‍රෝටීන් වලින් 10 μM, AF488-ලේබල් කළ αS 0.5 μM සහ Atto647N-ලේබල් කර ඇති Tau441).b αS/Tau441 බිංදු විලයන සිදුවීම්වල (එක් එක් ප්‍රෝටීන් සඳහා 10 μM) නියෝජිත අවකල මැදිහත්වීම් ප්‍රතිවිරුද්ධ (DIC) රූප.c Tau441 LLPS (0–15 µM) හි ආලෝකය විසිරීම (350 nm දී) මත පදනම් වූ අදියර රූප සටහන 50 µM αS නොමැති (වමේ) හෝ පැමිණීමේ (දකුණේ)උණුසුම් වර්ණ වැඩි විසිරීමක් පෙන්නුම් කරයි.d වැඩිවන αS සාන්ද්‍රණය සමඟින් αS/Tau441 LLPS සාම්පල ආලෝක විසිරීම (Tau441 at 5 µM, N = 2-3 නියැදි පුනරාවර්තන පෙන්වා ඇත).e මෙම අධ්‍යයනයේ දී භාවිතා කරන ලද සමහර tau ප්‍රෝටීන් ප්‍රභේදවල සහ ප්‍රෝටීනයේ විවිධ කලාපවල ක්‍රමානුකූල නිරූපණය: සෘණ ආරෝපිත N-පර්යන්ත වසම (රතු), proline පොහොසත් කලාපය (නිල්), microtubule-බන්ධන වසම (MTBD, තැඹිලි පැහැයෙන් උද්දීපනය කර ඇත) සහ ඇමයිලොයිඩ් සාදන යුගල සර්පිලාකාරය.MTBD (අළු) තුළ පිහිටා ඇති සූතිකා කලාප (PHF).Tau441 හි ඉතිරිය සඳහා ශුද්ධ ගාස්තු (NCPR) සිතියම පෙන්වා ඇත.f 1 µM AF488-ලේබල් කළ αS සහ Atto647N-ලේබල් කළ ΔNt-, 1 µM AF488-ලේබල් කරන ලද αS හෝ ΔCt-αS භාවිතා කරමින් ΔNt-Tau (ඉහළ, ප්‍රෝටීනයකට 10 µ0, ප්‍රෝටීනයකට µ8) ) ) LLPS හෝ K18 බෆරයේ ඝනීභවනය වූ WF හි මයික්‍රොග්‍රැෆ්.එක් රූපයක ඇති පරිමාණ තීරු එක් පුවරුවක ඇති සියලුම රූපවල පරිමාණය නියෝජනය කරයි (a, b සහ f පුවරු සඳහා 20 µm).c සහ d පැනල සඳහා අමු දත්ත අමු දත්ත ගොනු ලෙස සපයනු ලැබේ.
මෙම LLPS ක්‍රියාවලියේදී αS හි කාර්යභාරය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, NaCl හි වැඩි සාන්ද්‍රණයන් භාවිතා කරමින් නෙෆෙලෝමිතිය මගින් ජල බිඳිති ස්ථායීතාවයට αS හි බලපෑම පිළිබඳව අපි මුලින්ම විමර්ශනය කළෙමු (රූපය 2c).αS අඩංගු සාම්පලවල ලුණු සාන්ද්‍රණය වැඩි වන තරමට ආලෝක විසිරුම් අගයන් (350 nm දී) වැඩි වන අතර එය මෙම LLPS පද්ධතියේ αS හි ස්ථායීකරණ භූමිකාව පෙන්නුම් කරයි.αS සාන්ද්‍රණය (සහ එබැවින් αS:Tau441 අනුපාතය) දළ වශයෙන් වැඩි කිරීමෙන් සමාන බලපෑමක් නිරීක්ෂණය කළ හැක.tau සාන්ද්‍රණයට සාපේක්ෂව 10 ගුණයකින් වැඩි වීම (5 µM) (රූපය 2d).αS යනු coacervates වල පලංචිය ප්‍රෝටීනයක් බව පෙන්වීමට, ΔNt-Tau ලෙස හඳුන්වන සෘණ ආරෝපිත N-පර්යන්ත කලාපයක් (අවශේෂ 1-150, Fig. 2e බලන්න) නොමැති LLPS-බාධා කරන ලද Tau mutant ගේ හැසිරීම විමර්ශනය කිරීමට අපි තීරණය කළෙමු.WF අන්වීක්ෂය සහ nephelometry විසින් ΔNt-Tau විසින්ම LLPS (පය. 2f සහ පරිපූරක Fig. 2d) සිදු නොකළ බව තහවුරු කරන ලදී 14. කෙසේ වෙතත්, මෙම කප්පාදු කරන ලද Tau ප්‍රභේදයේ විසරණ විසඳුම්වලට αS එකතු කළ විට, LLPS ක්‍රියාවලිය සම්පූර්ණයෙන්ම සිදු විය. සමාන තත්ත්‍වයන් සහ ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණයන් යටතේ Tau සහ αS හි සම්පූර්ණ ප්‍රමාණයේ ද්‍රාවණවල ජල බිඳිති ඝනත්වයට ආසන්න ජල බිඳිති ඝනත්වයකින් ප්‍රතිෂ්ඨාපනය කර ඇත.මෙම ක්‍රියාවලිය අඩු සාර්ව අණුක ජනාකීර්ණ තත්වයන් යටතේද නිරීක්ෂණය කළ හැක (පරිපූරක Fig. 2c).LLPS ක්‍රියාවලියේදී C-පර්යන්ත αS කලාපයේ භූමිකාව, නමුත් එහි සම්පූර්ණ දිග නොවේ, (ΔCt- හි 104-140 (පය. 1a) හි අපද්‍රව්‍ය නොමැති C-පර්යන්ත කප්පාදු කරන ලද αS ප්‍රභේදයක් භාවිතා කරමින් ජල බිඳිති සෑදීම නිෂේධනය කිරීම මගින් පෙන්නුම් කරන ලදී. αS) ප්‍රෝටීන් (රූපය 2f සහ පරිපූරක රූපය 2d).αS සහ ΔNt-Tau වල colocalization confocal fluorescence microscopy (පරිපූරක Fig. 1b) මගින් තහවුරු කරන ලදී.
Tau441 සහ αS අතර LLPS යාන්ත්‍රණය තවදුරටත් පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අමතර Tau ප්‍රභේදයක් භාවිතා කරන ලදී, එනම් microtubule-binding domain (MTBD) හි යුගලනය කරන ලද හෙලික්සීය සූතිකා හරය (PHF) ඛණ්ඩය, එහි ලාක්ෂණික පුනරාවර්තන වසම් හතරක් තිබේ නම්, එය සාමාන්‍යයෙන් ද හැඳින්වේ. K18 කොටස ලෙස (රූපය 2e බලන්න).ක්ෂුද්‍ර නල බන්ධන වසමට පෙරාතුව අනුපිළිවෙලක proline පොහොසත් වසමක පිහිටා ඇති tau ප්‍රෝටීනයකට αS මනාප ලෙස බන්ධනය වන බව මෑතකදී වාර්තා විය.කෙසේ වෙතත්, PHF කලාපය ධන ආරෝපිත අපද්‍රව්‍ය වලින් ද පොහොසත් ය (රූපය 2e බලන්න), විශේෂයෙන් ලයිසීන් (15% අවශේෂ), මෙම කලාපය ද αS/Tau සංකීර්ණයේ ඝනීභවනයට දායක වේද යන්න පරීක්ෂා කිරීමට අපව පොළඹවන ලදී.පරීක්ෂා කරන ලද කොන්දේසි යටතේ K18 හට පමණක් 100 μM දක්වා සාන්ද්‍රණයකදී LLPS ක්‍රියාරම්භ කළ නොහැකි බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (15% PEG හෝ 20% dextran සහිත LLPS බෆරය) (රූපය 2f).කෙසේ වෙතත්, අපි 50 µM αS සිට 50 µM K18 දක්වා එකතු කළ විට, K18 සහ αS අඩංගු ප්‍රෝටීන් ජල බිඳිති සීඝ්‍ර ලෙස සෑදීම නෙෆෙලෝමිතිය (පරිපූරක රූපය 2d) සහ WF අන්වීක්ෂය (රූපය 2f) මගින් නිරීක්ෂණය කරන ලදී.අපේක්ෂා කළ පරිදි, ΔCt-αS හට K18 හි LLPS හැසිරීම ප්‍රතිස්ථාපනය කිරීමට නොහැකි විය (රූපය 2f).αS/ΔNt-Tau හෝ αS/Tau441 හා සසඳන විට එල්එල්පීඑස් ප්‍රේරණය කිරීම සඳහා αS/K18 එකතු කිරීම සඳහා තරමක් ඉහළ ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණයක් අවශ්‍ය බව අපි සටහන් කරමු, අනෙකුත් දේවල් සමාන වේ.මෙය පෙර 31 විස්තර කර ඇති පරිදි ක්ෂුද්‍ර නල බන්ධන වසම හා සසඳන විට ප්‍රෝලීන් පොහොසත් Tau වසම සමඟ αS C-පර්යන්ත කලාපයේ ශක්තිමත් අන්තර්ක්‍රියාවකට අනුකූල වේ.
αS නොමැති විට ΔNt-Tau හට LLPS සිදු කළ නොහැකි නිසා, අපි මෙම Tau ප්‍රභේදය αS/Tau LLPS ගුනාංගීකරනය කිරීමේ ආකෘතියක් ලෙස තෝරා ගත්තේ පූර්ණ-දිග Tau (සමාජ වර්ගය, Tau441/Tau441) සහිත LLPS පද්ධතිවල එහි සරල බව සැලකිල්ලට ගෙනය.සංකීර්ණ (heterotypic, αS/Tau441) එකතු කිරීමේ ක්‍රියාවලි සමඟ.අපි කේන්ද්‍රාපසාරී සහ විසිරුණු අදියර SDS-PAGE විශ්ලේෂණය (2e බලන්න) මගින් αS/Tau සහ αS/ΔNt-Tau පද්ධතිවල αS එකතු කිරීමේ උපාධිය (ඝනීකෘත අදියර ප්‍රෝටීනයේ කොටසක් ලෙස, fαS,c) සංසන්දනය කළෙමු (2e බලන්න), ඉතා සමාන අගයන් සොයා ගන්නා ලදී. එකම සාන්ද්‍රණයකින් සියලුම ප්‍රෝටීන සඳහා.විශේෂයෙන්ම, අපි αS/Tau සහ αS/ΔNt-Tau සඳහා fαS,c 84 ± 2% සහ 79 ± 7% ලබා ගත්තෙමු, αS සහ tau අතර විෂම අන්තර්ක්‍රියා tau අණු අතර අන්තර්ක්‍රියාවලට වඩා උසස් බව යෝජනා කරයි.අතර.
විවිධ පොලිකේෂන් සමඟ අන්තර්ක්‍රියා සහ αS චාලකයේ ඝනීභවනය කිරීමේ ක්‍රියාවලියේ බලපෑම ප්‍රථමයෙන් අධ්‍යයනය කරන ලද්දේ ෆොටෝබ්ලීචිං (FRAP) ක්‍රමයෙන් පසු ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රතිසාධනය මගිනි.අපි αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau සහ αS/pLK coacervates (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS සහ 100 μM Tau441 හෝ ΔNt-Tauk සමඟ පරිපූරණය කරන ලද) පරීක්‍ෂා කළෙමු.නියැදි සංරචක මිශ්ර කිරීමෙන් පසු පළමු මිනිත්තු 30 තුළ දත්ත ලබා ගන්නා ලදී.නියෝජිත FRAP රූප (පය. 3a, αS/Tau441 ඝනීභවනය) සහ ඒවාට අනුරූප කාල පාඨමාලා වක්‍ර (පය. 3b, පරිපූරක පය. 3), αS චාලක Tau441 coacervates වලට බෙහෙවින් සමාන බව දැකිය හැක.සහ ΔNt-Tau, pLK සමඟ වඩා වේගවත් වේ.FRAP (Kang et al. 35 විසින් විස්තර කර ඇති පරිදි) අනුව coacervate ඇතුළත αS සඳහා ගණනය කරන ලද විසරණ සංගුණක D = 0.013 ± 0.009 µm2/s සහ D = 0.026 ± 0.008 µm2/s සඳහා αS/Tau-44 සඳහා αS / පද්ධතිය.pLK, Tau, සහ D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, පිළිවෙලින් (රූපය 3c).කෙසේ වෙතත්, විසුරුවා හරින ලද අදියරෙහි විසරණ සංගුණකය αS, ප්‍රතිදීප්ත සහසම්බන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (FCS, පරිපූරක පය. 3 බලන්න) මගින් තීරණය කරනු ලබන පරිදි, එකම කොන්දේසි යටතේ (LLPS බෆරය) නමුත් බහුකාරක නොමැති විට, සියලු ඝනීභවනය වූ අදියරවලට වඩා විශාලත්වයේ ඇණවුම් කිහිපයක් වේ. (D = 8 ± 4 µm2/s).එබැවින්, උච්චාරණය කරන ලද අණුක ජනාකීර්ණ බලපෑම් හේතුවෙන් විසුරුවා හරින ලද අවධියේ ප්‍රෝටීන හා සසඳන විට αS පරිවර්තනවල චාලක විද්‍යාව සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වේ, නමුත් සියලුම කෝසර්වේට් ඒවා සෑදීමෙන් පසු පළමු පැය භාගය තුළ ද්‍රව වැනි ගුණාංග රඳවා තබා ගනී, නමුත් tau අවධියට ප්‍රතිවිරුද්ධව.pLK ඝනීභවනය තුළ වේගවත් චාලක.
විද්‍යුත් ස්ථිතික කෝසර්වේට් වල αS ගතිකයේ (2% AF488-ලේබල් αS) a-c FRAP විශ්ලේෂණය.αS/Tau441 FRAP විශ්ලේෂණවල නියෝජිත රූප ත්‍රිත්ව (a) හි පෙන්වා ඇත, එහිදී රතු කවයන් අවර්ණ කළ ප්‍රදේශ දක්වයි.පරිමාණ තීරුව 5 µm වේ.b සාමාන්‍ය FRAP වක්‍ර සහ (c) 5-6 (N) සඳහා ගණනය කරන ලද විසරණ සංගුණක (D) 100 µM αS සහ Tau441 (රතු) හෝ ΔNt-Tau (නිල්) හෝ pLK (කොළ) හි සමමූල සාන්ද්‍රණය භාවිතා කරමින් අත්හදා බැලීම් තුනකින් විවිධ ජල බිඳිති LLPS හි සාන්ද්‍රණය මෙන් දස ගුණයකින්.FRAP වක්‍රයේ සම්මත අපගමනය සෙවන ලද වර්ණයෙන් දැක්වේ.සංසන්දනය කිරීම සඳහා, විසරණය වූ අදියරෙහි විසරණ සංගුණකය αS ප්‍රතිදීප්ත සහසම්බන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (FCS) භාවිතයෙන් තුන් ගුණයකින් තීරණය කරන ලදී (වැඩිදුර තොරතුරු සඳහා පරිපූරක රූප සටහන 3 සහ ක්‍රම බලන්න).d LLPS බෆරයේ 100 μM TEMPOL-122-αS අඛණ්ඩ X-බෑන්ඩ් EPR වර්ණාවලි LLPS බෆරය තුළ කිසිදු පොලිකේෂන් (කළු) නොමැතිව හෝ 100 μM Tau441 (රතු) හෝ ΔNt-Tau (නිල්) හෝ 1 mM pLK (කොළ).වඩාත් නාටකාකාර වෙනස්කම් සිදුවන ප්‍රබල ක්ෂේත්‍ර රේඛා වල විශාලනය කළ දර්ශනයක් ඇතුළු කිරීම පෙන්වයි.50 μM TEMPOL-122-αS බන්ධන වක්‍ර LLPS නොමැති විට විවිධ පොලිකේෂන් සමඟ (PEG නොමැත).සාමාන්‍යකරණය කරන ලද EPR වර්ණාවලියේ II (IIII/III) කලාපයට සාපේක්ෂව III කලාපයේ අඩු වූ විස්තාරය Tau441 (රතු), ΔNt-Tau (නිල්) සහ pLK (කොළ) යන මවුල අනුපාත වැඩි කරන බව පෙන්වයි.වර්ණ රේඛා එක් එක් වක්‍රය මත n සමාන සහ ස්වාධීන බන්ධන අඩවි සහිත දළ බන්ධන ආකෘතියක් භාවිතා කරමින් දත්ත වලට ගැලපෙන බව පෙන්වයි.අමු දත්ත අමු දත්ත ගොනු ආකාරයෙන් සපයනු ලැබේ.
අනුපූරකයක් ලෙස, අපි අධ්‍යක්ෂණය කරන ලද භ්‍රමණය ලේබල් කිරීම (SDSL) සහ අඛණ්ඩ ඉලෙක්ට්‍රෝන පරචුම්භක අනුනාදනය (CW-EPR) භාවිතා කරමින් විවිධ කෝසර්වේට් වල αS හි ගතිකත්වය විමර්ශනය කළෙමු.යථාර්ථවාදී අවශේෂ විභේදනය36,37,38 සමඟ අවතැන් වූවන්ගේ නම්‍යශීලී බව සහ ගතිකත්වය වාර්තා කිරීමේදී මෙම ක්‍රමය ඉතා ප්‍රයෝජනවත් බව ඔප්පු වී ඇත.මේ සඳහා, අපි තනි Cys mutants තුළ cysteine ​​අපද්‍රව්‍ය ගොඩනඟා 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) ස්පින් පරීක්ෂණය භාවිතා කළෙමු.Maleimide ව්‍යුත්පන්නයන් ඒවා ලේබල් කරයි.වඩාත් නිශ්චිතව, අපි 122 හෝ 24 αS (TEMPOL-122-αS සහ TEMPOL-24-αS) ස්ථානයේ TEMPOL පරීක්ෂණ ඇතුළත් කළෙමු.පළමු අවස්ථාවේදී, අපි පොලිකේෂන් සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන ප්‍රෝටීනයේ C-පර්යන්ත කලාපය ඉලක්ක කරමු.ඒ වෙනුවට, 24 ස්ථානයෙන් අපට ඝනීභවනයේ ඇති ප්‍රෝටීනවල සමස්ත ගතිකත්වය පිළිබඳ තොරතුරු ලබා දිය හැක.අවස්ථා දෙකේදීම, විසුරුවා හරින ලද අදියරෙහි ප්රෝටීන සඳහා ලබාගත් EPR සංඥා වේගයෙන් චලනය වන තත්වයේ නයිට්රොක්සයිඩ් රැඩිකල් වලට අනුරූප වේ.tau හෝ pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 හෝ ΔNt-Tau 1:1 අනුපාතයකින් හෝ pLK 1:10 අනුපාතයකින්) අදියර වෙන් කිරීමෙන් පසුව, සාපේක්ෂ උපරිම තීව්‍රතාවයේ වැඩි වීමක් නිරීක්ෂණය විය. αS හි EPR වර්ණාවලිය.තනුක අවධියේ ප්‍රෝටීන් හා සසඳන විට ජල බිඳිතිවල අඩු වූ αS ප්‍රතිසංවිධාන චාලක පෙන්නුම් කරමින් පාඩු රේඛාව පුළුල් විය (රූපය 3d, පරිපූරක Fig. 4a).මෙම වෙනස්කම් 122 ස්ථානයේ දී වඩාත් කැපී පෙනේ. 24 වන ස්ථානයේ pLK පැවතීම පරීක්ෂණයේ චාලකයට බල නොපාන අතර, 122 ස්ථානයේ දී වර්ණාවලි රේඛා හැඩය සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් විය (පරිපූරක Fig. 4a).ස්පින්-ලේබල් කරන ලද IDP38,39 හි ගතිකත්වය විස්තර කිරීමට බහුලව භාවිතා වන සමස්ථානික ආකෘතිය (පරිපූරක රූප සටහන 5a) භාවිතා කරමින් αS/පොලිකේෂන් පද්ධති දෙකක 122 ස්ථානයේ වර්ණාවලිය ආකෘති කිරීමට අප උත්සාහ කළ විට, අපට පර්යේෂණාත්මක වර්ණාවලි ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමට නොහැකි විය..24 භ්‍රමණ ප්‍රතිවිරෝධතාවල පිහිටුමේ වර්ණාවලි අනුකරණය (පරිපූරක Fig. 5a).මෙමගින් යෝජනා කරන්නේ αS හි C-පර්යන්ත කලාපයේ භ්‍රමණ වින්‍යාසයන්හි අවකාශයේ බහුඅවයව ඉදිරියේ මනාප ස්ථාන පවතින බවයි.පර්යේෂණාත්මක EPR තත්ත්‍වයන් යටතේ ඝනීභවනය කරන ලද අදියරෙහි αS භාගය සලකා බලන විට (84 ± 2%, 79 ± 7%, සහ 47 ± 4% සඳහා αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, සහ αS/pLK, පිළිවෙලින්-බලන්න. දත්ත විශ්ලේෂණ c හි Fig. 2e), EPR ක්‍රමය මගින් අනාවරණය කර ගන්නා ලද පුළුල් වීම ප්‍රධාන වශයෙන් αS හි C-පර්යන්ත කලාපයේ විවිධ බහුඅවයවික සමග ඝණීකෘත අවධියේ අන්තර්ක්‍රියා පිළිබිඹු කරන බව දැකගත හැකිය (TEMPOL-122- භාවිතා කරන විට ප්‍රධාන වෙනස. αS), සහ ප්‍රෝටීන් ඝනීභවනය නොවේ.පරීක්ෂණයේ දී ක්ෂුද්ර ප්රෝටෝන වැඩි වීමක් දක්නට ලැබේ.අපේක්ෂා කළ පරිදි, මිශ්‍රණයට 1 M NaCl එකතු කළ විට LLPS හැර වෙනත් කොන්දේසි යටතේ ප්‍රෝටීනයේ EPR වර්ණාවලිය සම්පූර්ණයෙන්ම යථා තත්ත්වයට පත් විය (පරිපූරක Fig. 4b).සමස්තයක් වශයෙන්, අපගේ දත්ත යෝජනා කරන්නේ CW-EPR විසින් අනාවරණය කරගත් වෙනස්කම් ප්‍රධාන වශයෙන් αS හි C-පර්යන්ත කලාපයේ ඝනීභවනය වූ අවධියේ විවිධ බහුකාරක සමඟ අන්තර්ක්‍රියා පිළිබිඹු කරන අතර, මෙම අන්තර්ක්‍රියාකාරිත්වය Tau සමඟ වඩා pLK සමඟ ශක්තිමත් බව පෙනේ.
coacervate හි ඇති ප්‍රෝටීන පිළිබඳ වඩාත් ව්‍යුහාත්මක තොරතුරු ලබා ගැනීම සඳහා, අපි විසඳුමක NMR භාවිතා කරමින් LLPS පද්ධතිය අධ්‍යයනය කිරීමට තීරණය කළෙමු.කෙසේ වෙතත්, අපට හඳුනාගත හැක්කේ විසුරුවා හරින ලද අවධියේ ඉතිරිව ඇති αS භාගය පමණි, එය coacervate තුළ ඇති ප්‍රෝටීන් ගතිකතාවයන් අඩු වීම සහ NMR විශ්ලේෂණයේදී ද්‍රාවණයේ පතුලේ ඝන අවධියක් නිසා විය හැක.අපි NMR (පරිපූරක Fig. 5c, d) භාවිතයෙන් LLPS නියැදියේ විසිරුණු අවධියේ ඉතිරිව ඇති ප්‍රෝටීනයේ ව්‍යුහය සහ ගතිකත්වය විශ්ලේෂණය කළ විට, pLK සහ ΔNt-Tau යන දෙකම ඉදිරියේ ප්‍රෝටීනය පාහේ සමාන ලෙස හැසිරෙන බව අපි දුටුවෙමු. ප්‍රෝටීන් කොඳු ඇට පෙළේ ද්විතියික ව්‍යුහය සහ ගතිකත්වය තුළ පැවති, ද්විතියික රසායනික මාරුව සහ R1ρ ලිහිල් කිරීම පිළිබඳ පර්යේෂණ මගින් අනාවරණය විය.NMR දත්ත පෙන්නුම් කරන්නේ αS හි C-පර්යන්තය බහුඅවයවික සමඟ ඇති අන්තර්ක්‍රියා හේතුවෙන් අනෙකුත් ප්‍රෝටීන් අනුක්‍රමය මෙන් එහි අක්‍රමිකතා ස්වභාවය රඳවා ගනිමින් අනුකූල නම්‍යශීලීභාවයේ සැලකිය යුතු අලාභයක් අත්විඳින බවයි.
TEMPOL-122-αS ඝනීභවනය කරන ලද අදියරේදී නිරීක්ෂණය කරන ලද CW-EPR සංඥා පුළුල් කිරීම ප්‍රෝටීන් බහුඅවයවික සමඟ අන්තර්ක්‍රියා පිළිබිඹු කරන බැවින්, අපි LLPS නොමැති විට (කිසිදු සමුච්චයක් නොමැතිව විවිධ පොලිකේෂන් වලට αS හි බන්ධන සම්බන්ධතාව තක්සේරු කිරීමට EPR ටයිටරේෂන් එකක් සිදු කළෙමු. බෆර් LLPS), අන්තර්ක්‍රියා තනුක සහ සාන්ද්‍රිත අවධීන්හිදී සමාන බව යෝජනා කරයි (අපගේ දත්ත, පරිපූරක Fig. 4a සහ පරිපූරක Fig. 6 මගින් තහවුරු වේ).ඉලක්කය වූයේ සියලුම coacervates, ඒවායේ පොදු තරල වැනි ගුණාංග තිබියදීත්, අණුක මට්ටමින් කිසියම් යටින් පවතින අවකල්‍ය හැසිරීම් ප්‍රදර්ශනය කරන්නේ දැයි බැලීමයි.අපේක්ෂා කළ පරිදි, EPR වර්ණාවලිය බහුඅවයව සාන්ද්‍රණය වැඩි වීමත් සමඟ පුළුල් වූ අතර, සියලුම අන්තර්ක්‍රියා හවුල්කරුවන්ගේ අණුක අන්තර්ක්‍රියා හේතුවෙන් සංතෘප්තියට පාහේ අණුක නම්‍යශීලීභාවයේ අඩු වීමක් පිළිබිඹු කරයි (රූපය 3e, අතිරේක Fig. 6).ΔNt-Tau සහ Tau441 හා සසඳන විට pLK මෙම සන්තෘප්තිය ලබා ගත්තේ අඩු molar අනුපාතයකින් (polycation:αS) ය.ඇත්ත වශයෙන්ම, n සමාන සහ ස්වාධීන බන්ධන අඩවි උපකල්පනය කරමින් දළ වශයෙන් බන්ධන ආකෘතියක් සමඟ දත්ත සංසන්දනය කිරීමෙන් පෙන්නුම් කළේ pLK (~5 μM) හි පෙනෙන විඝටන නියතය Tau441 හෝ ΔNt-Tau (~50 μM) ට වඩා විශාලත්වයේ අනුපිළිවෙලක් බවයි. )µM).මෙය දළ ඇස්තමේන්තුවක් වුවද, අඛණ්ඩ ධන ආරෝපණ කලාප සහිත සරල බහුකරණයන් සඳහා αS ට වැඩි බැඳීමක් ඇති බව මෙයින් ඇඟවෙයි.αS සහ විවිධ පොලිකේෂන් අතර ඇති සම්බන්ධතාවයේ මෙම වෙනස සැලකිල්ලට ගෙන, ඒවායේ ද්‍රව ගුණ කාලයත් සමඟ වෙනස් ලෙස වෙනස් විය හැකි අතර විවිධ LSPT ක්‍රියාවලීන්ගෙන් පීඩා විඳිය හැකි බව අපි උපකල්පනය කළෙමු.
ප්‍රෝටීන් කෝසර්වේට් තුළ ඇති අධික ජනාකීර්ණ පරිසරය සහ ප්‍රෝටීනයේ ඇමයිලොයිඩ් ස්වභාවය අනුව, හැකි LSPT ක්‍රියාවලීන් හඳුනා ගැනීම සඳහා කාලයත් සමඟ coacervate හි හැසිරීම අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු.BF සහ CF අන්වීක්ෂය භාවිතයෙන් (රූපය 4), අපි නිරීක්ෂණය කළ පරිදි, αS/Tau441 ද්‍රාවණයේ විශාල ප්‍රමාණයකට coacervates, බලාපොරොත්තු වූ පරිදි, ළිඳේ/ස්ලයිඩයේ පතුලෙහි සම්පූර්ණ ජල බිඳිති ලෙස ස්පර්ශ වන සහ තෙත් කරන විශාල ජල බිඳිති සාදයි (පරිපූරක රූපය .7d);අපි මෙම පතුලේ පිහිටුවා ඇති ව්යුහයන් "ප්රෝටීන් පරාල" ලෙස හඳුන්වමු.මෙම ව්‍යුහයන් ෆියුස් කිරීමේ හැකියාව රඳවා ගත් බැවින් ඒවා තරල ලෙස පැවතුනි (පරිපූරක Fig. 7b) සහ LLPS ක්‍රියාවට නැංවීමෙන් පසු පැය කිහිපයක් දැක ගත හැකි විය (රූපය 4 සහ පරිපූරක Fig. 7c).අසමතුලිත ආරෝපණ සහ ඉහළ විද්‍යුත් ස්ථිතික පෘෂ්ඨ විභවයන් සහිත විද්‍යුත් ස්ථිතික කෝසර්වේට් සඳහා බලාපොරොත්තු වන පරිදි තෙත් කිරීමේ ක්‍රියාවලිය හයිඩ්‍රොෆොබික් ද්‍රව්‍යවලට වඩා ජලාකර්ෂණීය මතුපිටට අනුග්‍රහය දක්වන බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (පරිපූරක Fig. 7a).සැලකිය යුතු ලෙස, αS/ΔNt-Tau coalescence සහ rafting සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වී ඇති අතර, αS/pLK ඝනීභවනය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු විය (රූපය 4).කෙටි ඉන්කියුබේෂන් කාලය තුළ, αS/pLK ජල බිඳිති එකට එකතු වී හයිඩ්‍රොෆිලික් මතුපිට තෙත් කිරීමට සමත් විය, නමුත් මෙම ක්‍රියාවලිය ඉක්මනින් නතර වූ අතර ඉන්කියුබේෂන් පැය 5 කට පසුව සීමිත සංයෝජන සිදුවීම් පමණක් වන අතර තෙත් වීමක් දක්නට නොලැබුණි.- ජෙල් බිංදු සංක්‍රමණය.
100 µM αS (1% ප්‍රතිදීප්ත ලේබලය) අඩංගු coacervate සාම්පලවල නියෝජිත BF (අළු පැහැති පුවරු) සහ CF (දකුණු පුවරු, AF488-ලේබල් කරන ලද αS කොළ පැහැති) LLPS බෆරයේ 100 µM Taufluoresct picstop ඉදිරියේ -Tau (මැද) හෝ 1 mM pLK (පහළ) විවිධ ඉන්කියුබේෂන් වේලාවන් සහ නාභීය උස (z, තහඩු ළිඳේ පතුලේ සිට දුර).අත්හදා බැලීම් 4-6 වාරයක් ස්වාධීනව එකම ප්රතිඵල සමඟ නැවත නැවතත් සිදු කරන ලදී.αS/Tau441 coacervates පැය 24කට පසු තෙත් කර රූපයට වඩා විශාල පරාල සාදයි.සියලුම පින්තූර සඳහා පරිමාණ තීරුව 20 µm වේ.
αS/Tau441 LLPS හි පිහිටුවා ඇති විශාල තරල වැනි ප්‍රෝටීන් තටාක අධ්‍යයනය කරන ලද ඕනෑම ප්‍රෝටීනයක ඇමයිලොයිඩ් සමුච්චය වීමට හේතු වේද යන්න අපි පසුව විමසුවෙමු.අපි ඉහත කොන්දේසි යටතේම WF අන්වීක්ෂය සමඟ කාලයත් සමඟ αS/Tau441 ජල බිඳිති පරිණත වීම අනුගමනය කළ නමුත්, 1 μM AF488-ලේබල් කළ αS සහ Atto647N-ලේබල් කළ Tau441 (රූපය 5a) භාවිතා කළෙමු.අපේක්ෂා කළ පරිදි, අපි පරිණත ක්රියාවලිය පුරාම සම්පූර්ණ ප්රෝටීන් දේශීයකරණය නිරීක්ෂණය කළෙමු.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, ca සිට.පැය 5 කට පසු, පරාල තුළ වඩාත් තීව්‍ර නොවන චක්‍රලේඛ ව්‍යුහයන් නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර, ඒවා අපි “ලකුණු” ලෙස හැඳින්වූ අතර, ඒවායින් සමහරක් αS සමඟ ඒකාබද්ධ වූ අතර සමහර ඒවා Tau441 (රූපය 5a, සුදු ඊතල) වලින් පොහොසත් විය.αS/ΔNt-Tau සඳහා වඩා αS/ΔNt-Tau සඳහා මෙම ලප සෑම විටම පරාල තුළ නිරීක්ෂණය වී ඇත.විලයන/තෙත් කිරීම සඳහා අකාර්යක්ෂම pLK සහ Tau පද්ධතිවල ජල බිඳිතිවල පැහැදිලි ලප නොතිබුණි.αS සහ Tau441 අඩංගු මෙම පැල්ලම් ඇමයිලොයිඩ්-සමාන සමස්ථ දැයි පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි CF අන්වීක්ෂය භාවිතයෙන් සමාන පරීක්ෂණයක් සිදු කළෙමු, එහි Tau441 Atto647N සමඟ ලේබල් කර 12.5 μM ඇමයිලොයිඩ්-විශේෂිත thioflavin-T (ThT) ආරම්භයේ සිට එකතු කරන ලදී.ඩයි.αS/Tau441 ජල බිඳිති හෝ පරාල වල ThT-staining පැය 24කට පසුව පවා නිරීක්ෂණය නොකළද (රූපය 5b, ඉහළ පේළිය - ප්‍රෝටීන් පරාල මත ඉතිරි ජල බිඳිති), පරාල තුළ Atto647N-Tau441 අඩංගු ThT-ධනාත්මක ව්‍යුහයන් ඉතා දුර්වල විය.මෙය කලින් විස්තර කර ඇති ලප වල ප්‍රමාණය, හැඩය සහ ස්ථානය ප්‍රතිනිර්මාණය කරයි (රූපය 5b, මැද සහ පහළ පේළි), වයස්ගත වන තරල coacervates වල සෑදෙන ඇමයිලොයිඩ් වැනි සමූහයන්ට එම ලප අනුරූප විය හැකි බව යෝජනා කරයි.
LLPS බෆර තහඩුවක ළිඳක 25 μM Tau441 (1 μM AF488-ලේබල් කරන ලද αS සහ Atto647N-ලේබල් කරන ලද Tau441) ඉදිරියේ විවිධ ඉන්කියුබේෂන් වේලාවන් සහ නාභීය උස (z, නොබැඳි පතුලේ සිට දුර) WF 25 μM αS. .සමාන ප්‍රතිඵල සහිතව අත්හදා බැලීම් හයක් ස්වාධීනව නැවත නැවතත් කරන ලදී.b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-ලේබල් කරන ලද Tau441) සහ 12.5 μM thioflavin-T (ThT) ඉදිරියේ 25 μM αS හි CF අන්වීක්ෂීය රූපය.බර ප්‍රෝටීන් බිංදු සහ තැන්පත් වූ ප්‍රෝටීන් පරාල සහ ලප පිළිවෙලින් ඉහළ සහ මැද පේළිවල දැක්වේ.පහළ පේළිය ස්වාධීන අනුරූ 3 කින් පරාල සහ බිංදු වල රූප පෙන්වයි.සුදු ඊතල මඟින් පුවරු දෙකෙහිම ThT-ධන තිත් දක්වයි.සියලුම පින්තූර සඳහා පරිමාණ තීරුව 20 µm වේ.
ද්‍රවයේ සිට ඝණ දක්වා සංක්‍රමණය වීමේදී coacervate ප්‍රෝටීන් ජාලයේ වෙනස්වීම් වඩාත් විස්තරාත්මකව පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි fluorescence lifetime imaging (FLIM) සහ Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) භාවිතා කළෙමු (රූපය 6 සහ අතිරේක රූප 8 සහ 9).ස්තරය වඩාත් ඝනීභවනය වූ හෝ ඝන-සමාන සමූහගත ප්‍රෝටීන් ව්‍යුහයකට කෝසර්වේට් මේරීම ප්‍රෝටීන් සහ එයට සම්බන්ධ ප්‍රතිදීප්ත පරීක්ෂණය අතර සමීප සම්බන්ධතාවක් ඇති කරයි, කෙටි ගවේෂණ ජීවිත කාලයකදී (τ) ප්‍රකාශිත නිවාදැමීමේ බලපෑමක් ඇති කළ හැකි බව අපි උපකල්පනය කළෙමු. , කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි40.,41,42.මීට අමතරව, ද්විත්ව ලේබල් කරන ලද සාම්පල සඳහා (AF488 සහ Atto647N, පිළිවෙලින් FRET පරිත්‍යාගශීලි සහ පිළිගැනීමේ සායම් ලෙස), τ හි මෙම අඩුවීම coacervate ඝනීභවනය සහ LSPT තුළ FRET(E) කාර්යක්ෂමතාවයේ වැඩි වීමක් සමඟ ද සිදු විය හැක.අපි කාලයත් සමඟ LLPS αS/Tau441 සහ αS/ΔNt-Tau සාම්පල (αS සහ/හෝ Tau441 හෝ Tau ලෙස ලේබල් කර ඇති Atto647N AF488 අඩංගු LLPS බෆරයේ එක් එක් ප්‍රෝටීන් වලින් 25 µM) පරාලය සහ ස්ථාන සෑදීම නිරීක්ෂණය කළෙමු.AF488 (τ488) සහ Atto647N (τ647N) ගවේෂණවල ප්‍රතිදීප්ත ආයු කාලය coacervates පරිණත වන විට සුළු වශයෙන් අඩු වූ බව අපි සාමාන්‍ය ප්‍රවණතාවක් නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 6 සහ පරිපූරක Fig. 8c).සිත්ගන්නා කරුණ නම්, මෙම වෙනස පරාල තුළ ඇති තිත් සඳහා සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි දියුණු කර ඇත (රූපය 6c), තිත්වල තවදුරටත් ප්‍රෝටීන් ඝනීභවනය සිදු වූ බව පෙන්නුම් කරයි.මෙයට සහය දැක්වීමක් වශයෙන්, 24 h සඳහා වයස්ගත වූ αS/ΔNt-Tau ජල බිඳිති සඳහා ප්‍රතිදීප්ත ආයු කාලයෙහි සැලකිය යුතු වෙනසක් දක්නට නොලැබුණි (පරිපූරක Fig. 8d), ජල බිඳිති ජෙලේෂන් යනු පැල්ලම් වලින් වෙනස් වූ ක්‍රියාවලියක් වන අතර එය සැලකිය යුතු අණුක ප්‍රතිසංවිධානයක් සමඟින් සිදු නොවේ. coacervates තුළ.විශේෂයෙන්ම αS/Tau441 පද්ධතිය සඳහා (පරිපූරක Fig. 8e) තිත් විවිධ ප්‍රමාණවලින් සහ αS හි විචල්‍ය අන්තර්ගතයන් ඇති බව සටහන් කළ යුතුය.ස්ථාන ප්‍රතිදීප්තියේ ආයු කාලය අඩුවීමත් සමඟ තීව්‍රතාවයේ වැඩි වීමක් සිදු විය, විශේෂයෙන්ම Atto647N ලේබල් කරන ලද Tau441 (පරිපූරක Fig. 8a) සඳහා සහ αS/Tau441 සහ αS/ΔNt-Tau පද්ධති දෙක සඳහා ඉහළ FRET කාර්යක්ෂමතාව, තවදුරටත් PS පැය පහක් පෙන්නුම් කරයි. ප්‍රේරණය කිරීමෙන් පසු ස්ථිතික විදුලිය තුළ ඇති ප්‍රෝටීන ඝනීභවනය විය.αS/ΔNt-Tau හා සසඳන විට, අපි αS/Tau441 ස්ථාන වල අඩු τ647N සහ තරමක් ඉහළ τ488 අගයන්, අඩු සහ වැඩි අසමජාතීය FRET අගයන් සමඟින් නිරීක්ෂණය කළෙමු.සමහර විට, මෙය αS/Tau441 පද්ධතියේ නිරීක්ෂණය කරන ලද සහ අපේක්ෂිත αS බහුලත්වය Tau හා සසඳන විට වඩාත් විෂමජාතීය, බොහෝ විට උපස්ථිතිමිතික වේ, මන්ද Tau441 විසින්ම LLPS සහ එකතු කිරීම් වලට භාජනය විය හැකි බැවින් (පරිපූරක Fig. 8). .කෙසේ වෙතත්, Tau441 සහ αS යන දෙකම පවතින විට ජල බිඳිති ඒකාබද්ධ වීමේ මට්ටම, පරාල සෑදීම සහ, වැදගත් ලෙස, ද්‍රව-සමාන කෝසර්වේට් තුළ ප්‍රෝටීන් සමුච්චය වීම උපරිම වේ.
එක් එක් ප්‍රෝටීන වල 25 μM හි αS/Tau441 සහ αS/ΔNt-Tau හි ජීවිත කාලය තුළ ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂ (FLIM) රූප (1 μM AF488-ලේබල් කරන ලද αS සහ 1 μM Atto647N-ලේබල් කර ඇති Tau441-TauPS හි Tau441-Tau ΔP.තීරු විවිධ පරිණත කාලවලදී (මිනිත්තු 30, පැය 5 සහ පැය 24) LLPS සාම්පලවල නියෝජිත රූප පෙන්වයි.රතු රාමුව αS/Tau441 ලප අඩංගු කලාපය පෙන්වයි.ආයු කාලය වර්ණ තීරු ලෙස දැක්වේ.සියලුම පින්තූර සඳහා පරිමාණ තීරුව = 20 µm.b පැනලයේ රතු කොටුවේ පෙන්වා ඇති තෝරාගත් ප්‍රදේශයේ FLIM රූපය විශාලනය කර ඇත.A පැනලයේ ඇති වර්ණ පරිමාණයම භාවිතා කරමින් ජීවන පරාස පෙන්වයි.පරිමාණ තීරුව = 5 µm.c විවිධ ප්‍රෝටීන් විශේෂ සඳහා AF488 (αS වෙත අමුණා ඇත) හෝ Atto647N (Tau වෙත අමුණා ඇති) පෙන්වන හිස්ටෝග්‍රෑම් (droplets-D-, raft-R- සහ speckle-P) αS- සඳහා වාර්තා කර ඇති FLIM රූපවල හඳුනාගෙන ඇත) Tau441 හි කාල බෙදාහැරීම් ජීවිත කාලය සහ αS/ΔNt-Tau coacervate සාම්පල (D සඳහා N = 17-32 ROI, R සඳහා 29-44 ROI, සහ ලකුණු සඳහා 21-51 ROI).මධ්‍ය සහ මධ්‍ය අගයන් පිළිවෙළින් පෙට්ටි තුළ කහ කොටු සහ කළු රේඛා ලෙස දැක්වේ.පෙට්ටියේ පහළ සහ ඉහළ මායිම් පිළිවෙලින් පළමු සහ තුන්වන කාර්තු නියෝජනය කරන අතර 1.5 ගුණයක අන්තර් කාර්තු පරාසය (IQR) තුළ ඇති අවම සහ උපරිම අගයන් උඩු රැවුල ලෙස දැක්වේ.පිටතින් කළු දියමන්ති ලෙස දැක්වේ.බෙදා හැරීම් යුගල අතර සංඛ්‍යානමය වැදගත්කම අසමාන විචල්‍යයන් උපකල්පනය කරමින් සාම්පල දෙකක ටී-පරීක්‍ෂණයක් භාවිතයෙන් නිර්ණය කරන ලදී.එක් එක් සංසන්දනාත්මක දත්ත යුගල සඳහා ද්විත්ව වලිග සහිත t-test p-අගයන් තරු ලකුණු සහිතව පෙන්වා ඇත (* p-value > 0.01, ** p-value > 0.001, *** p-value > 0.0001, **** p-අගය > 0.00001), ns නොසැලකිලිමත් බව පෙන්නුම් කරයි (p-අගය > 0.05).නිශ්චිත p අගයන් පරිපූරක වගුව 1 හි දක්වා ඇති අතර මුල් දත්ත අමු දත්ත ගොනු ලෙස ඉදිරිපත් කෙරේ.
ස්පෙකියුලම්/සමූහවල ඇමයිලොයිඩ් වැනි ස්වභාවය තවදුරටත් ප්‍රදර්ශනය කිරීම සඳහා, අපි (1 M) NaCl හි ඉහළ සාන්ද්‍රණයකින් පැය 24ක් පුරා නොකැඩූ coacervate සාම්පල ප්‍රතිකාර කළෙමු, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ප්‍රෝටීන් කෝසර්වේට් වලින් සමස්ථයන් වෙන් විය.පරමාණුක බල අන්වීක්ෂය (AFM) භාවිතයෙන් හුදකලා සමස්ථයන් (එනම් සමස්ථවල විසුරුවා හරින ලද ද්‍රාවණයක්) නිරීක්ෂණය කළ විට, අපි ප්‍රධාන වශයෙන් ගෝලාකාර රූප විද්‍යාව 15 nm පමණ නිත්‍ය උසකින් නිරීක්ෂණය කළෙමු, එය ඉහළ ලුණු සාන්ද්‍රණයක තත්වයන් යටතේ සම්බන්ධ වීමට නැඹුරු වේ. මතුපිට ඇති ප්‍රබල ජලභීතික බලපෑම හේතුවෙන් සාමාන්‍ය ඇමයිලොයිඩ් ෆයිබ්‍රිල් වල හැසිරීම (ෆයිබ්‍රිල් සාමාන්‍යයෙන් ~10 nm උස ඇති බව සලකන්න) (පරිපූරක Fig. 10a).සිත්ගන්නා කරුණ නම්, සම්මත ThT ප්‍රතිදීප්ත තක්සේරුවකදී හුදකලා සමස්ථයන් ThT සමඟ පුර්වීකරණය කළ විට, අපි ThT ප්‍රතිදීප්ත ක්වොන්ටම් අස්වැන්නේ නාටකාකාර වැඩි වීමක් නිරීක්ෂණය කළෙමු, සායම් සාමාන්‍ය αS ඇමයිලොයිඩ් ෆයිබ්‍රිල් (පරිපූරක Fig. coacervate සමස්ථයන් ඇමයිලොයිඩ් වැනි ව්‍යුහයන් අඩංගු වේ..ඇත්ත වශයෙන්ම, සමස්ථයන් ඉහළ ලවණ සාන්ද්‍රණයන්ට ඔරොත්තු දෙන නමුත් සාමාන්‍ය ඇමයිලොයිඩ් ෆයිබ්‍රිල් (පරිපූරක Fig. 10c) වැනි 4 M ගුවානයිඩින් ක්ලෝරයිඩ් (GdnHCl) වලට සංවේදී වේ.
මීළඟට, අපි තනි අණු ප්‍රතිදීප්තතාව, විශේෂිත ප්‍රතිදීප්ත සහසම්බන්ධය/හරස් සහසම්බන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (FCS/FCCS) සහ ද්වි-වර්ණ අහඹු හඳුනාගැනීමේ (TCCD) පිපිරුම් විශ්ලේෂණය භාවිතයෙන් සමස්ථවල සංයුතිය විශ්ලේෂණය කළෙමු.මේ සඳහා, අපි αS සහ Tau441 (දෙකම 25 μM) අඩංගු 100 μl LLPS සාම්පලවල 1 μM AF488-ලේබල් කළ αS සහ 1 μM Atto647N-ලේබල් කළ Tau6441 සමඟින් පැය 24ක පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරුවෙන් පසුව සාදන ලද සමස්ථයන් හුදකලා කළෙමු.LLPS සහ ප්‍රෝටීන අතර ඇති විය හැකි විද්‍යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්‍රියා වැලැක්වීම සඳහා එකම PEG-නිදහස් බෆරය සහ 1 M NaCl (coacervate වලින් සමස්ථයන් වෙන් කිරීමට භාවිතා කරන එකම බෆරය) භාවිතා කරමින් ප්‍රතිඵලයක් ලෙස විසුරුවා හරින ලද සමස්ථ ද්‍රාවණය ඒක අණුක තත්වයකට තනුක කරන්න.තනි අණුවක කාල පථය පිළිබඳ උදාහරණයක් රූප සටහන 7a හි දැකිය හැකිය.FCCS/FCS විශ්ලේෂණය (හරස් සහසම්බන්ධය, CC සහ ස්වයං සහසම්බන්ධය, AC) පෙන්නුම් කළේ සාම්පලවල αS සහ tau අඩංගු සමස්ථයන් බහුලව පවතින බවයි (රූපය 7b, වම් පුවරුවේ CC වක්‍රය බලන්න), සහ අවශේෂ මොනමරික් ප්‍රෝටීන් අතිරික්තයක් මතු විය. තනුක ක්රියාවලියේ ප්රතිඵලය (රූපය 7b, වම් පුවරුවේ AC වක්ර බලන්න).මොනොමරික් ප්‍රෝටීන පමණක් අඩංගු සාම්පල භාවිතයෙන් එකම විසඳුම් තත්ත්‍වයන් යටතේ සිදු කරන ලද පාලන අත්හදා බැලීම් CC වක්‍ර නොපෙන්වන අතර, AC වක්‍ර ඒක-සංරචක විසරණ ආකෘතිය (Eq. 4) සමඟ හොඳින් ගැලපේ, එහිදී මොනොමරික් ප්‍රෝටීන වල අපේක්ෂිත විසරණ සංගුණක ඇත (රූපය 7b. ), දකුණු පුවරුව).සමුච්චිත අංශුවල විසරණ සංගුණකය 1 µm2/s ට වඩා අඩු වන අතර මොනොමරික් ප්‍රෝටීන වල විසරණ සංගුණකය 1 µm2/s පමණ වේ.50-100 µm/s;සමාන විසඳුම් කොන්දේසි යටතේ වෙන වෙනම sonicated αS ඇමයිලොයිඩ් ෆයිබ්‍රිල් සහ මොනොමරික් αS සඳහා කලින් ප්‍රකාශිත අගයන්ට අගයන් සමාන වේ44.අපි TCCD පිපිරුම් විශ්ලේෂණය සමඟ සමස්ථයන් විශ්ලේෂණය කළ විට (රූපය 7c, ඉහළ පුවරුව), එක් එක් හුදකලා සමස්ථය (αS/Tau heteroaggregate), අනාවරණය කරගත් සමස්ථයන්ගෙන් 60% ක් පමණ αS සහ tau යන දෙකම අඩංගු වන අතර, 30% ක් පමණ අඩංගු වන්නේ 30% ක් පමණ පමණක් බව සොයා ගන්නා ලදී. tau, 10% පමණ αS පමණි.αS/Tau heteroaggregates හි Stoichiometric විශ්ලේෂණය පෙන්නුම් කළේ බොහෝ විෂම සමූහයන් tau වලින් පොහොසත් වී ඇති බවයි (stoichiometry 0.5 ට අඩු, සමස්ථයකට tau අණු වල සාමාන්‍ය සංඛ්‍යාව αS අණු වලට වඩා 4 ගුණයකින් වැඩිය), එය අපගේ වැඩ වලදී නිරීක්ෂණය කරන ලද FLIM සමඟ අනුකූල වේ. අත්හදා බැලීම්..FRET විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ මෙම සමස්ථවල ප්‍රෝටීන දෙකම අඩංගු වන බවයි, නමුත් මෙම නඩුවේ සත්‍ය FRET අගයන් විශාල වැදගත්කමක් නොතිබුණද, එක් එක් සමස්ථය තුළ ෆ්ලෝරෝෆෝර් බෙදා හැරීම අහඹු ලෙස සිදු වූයේ අත්හදා බැලීමේදී භාවිතා කරන ලද ලේබල් නොකළ ප්‍රෝටීන් අතිරික්තයක් නිසාය.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, අපි 45,46 පරිණත ඇමයිලොයිඩ් එකතු කිරීමේ-අඩුපාඩු සහිත Tau ප්‍රභේදය භාවිතා කර එම විශ්ලේෂණය සිදු කළ විට (පරිපූරක Fig. 11a,b බලන්න), αS විද්‍යුත් ස්ථිතික එකතුව සමාන වුවද (පරිපූරක Fig. 11c, d) coacervate තුළ සමස්ථ සෑදීමේ හැකියාව විශාල ලෙස අඩු වූ අතර FLIM ස්ථානීය අත්හදා බැලීම් වලදී ස්ථාන කිහිපයක් අනාවරණය කර ගත් අතර හුදකලා සමස්ථ සාම්පල සඳහා දුර්වල හරස් සහසම්බන්ධතා වක්‍ර නිරීක්ෂණය කරන ලදී.කෙසේ වෙතත්, හඳුනාගත් සමස්ථයන් කුඩා සංඛ්‍යාවක් සඳහා (Tau441 න් දශමයක් පමණි), මෙම Tau ප්‍රභේදයට වඩා αS වලින් එක් එක් සමස්ථයක් පොහොසත් වී ඇති බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු, අනාවරණය කරගත් සමස්ථයන්ගෙන් 50% ක් පමණ αS අණු පමණක් අඩංගු වන අතර αS විෂමජාතීය වේ. .Tau441 මගින් ජනනය කරන ලද විෂම සමස්ථයන්ට ප්‍රතිවිරුද්ධව (පරිපූරක Fig. 11e බලන්න) සමස්ථ (රූපය 6f).මෙම අත්හදා බැලීම්වල ප්‍රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කළේ αS ම coacervate තුළ tau සමඟ සමුච්චය වීමේ හැකියාව ඇති නමුත්, මෙම තත්ව යටතේ tau න්‍යෂ්ටිය වඩාත් හිතකර වන අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ඇතිවන ඇමයිලොයිඩ්-සමාන සමස්ථයන් αS සහ tau ආකාරයක් ලෙස ක්‍රියා කළ හැකි බවයි.කෙසේ වෙතත්, tau පොහොසත් හරයක් සෑදූ පසු, tau අණු අතර සමජාතීය අන්තර්ක්‍රියාවලට වඩා αS සහ tau අතර විෂමජාතික අන්තර්ක්‍රියා සමස්ථ වශයෙන් අනුග්‍රහය දක්වයි;අපි දියර αS/tau coacervates වල ප්‍රෝටීන් ජාල ද නිරීක්ෂණය කරමු.
αS/Tau441 විද්‍යුත් ස්ථිතික කෝසර්වේට් වල සෑදුනු හුදකලා සමස්ථවල තනි අණු වල නියෝජිත ප්‍රතිදීප්ත තාවකාලික අංශු.αS/Tau441 coaggregates වලට අනුරූප පිපිරුම් (පෙන්වන ලද එළිපත්තට ඉහලින් ඇති පිපිරීම්) හඳුනාගැනීමේ නාලිකා තුනක (AF488 සහ Atto647N සෘජු උද්දීපනයෙන් පසු විමෝචනය, නිල් සහ රතු රේඛා, වක්‍ර උද්දීපනයෙන් පසු Atto647N විමෝචනය), FRET, වයලට් රේඛාව) නිරීක්ෂණය කරන ලදී.b LLPS (වම් පුවරුව) වෙතින් ලබාගත් හුදකලා αS/Tau441 සමස්ථ නියැදියක FCS/FCCS විශ්ලේෂණය.AF488 සහ Atto647N සඳහා ස්වයං සහසම්බන්ධතා (AC) වක්‍ර පිළිවෙලින් නිල් සහ රතු පැහැයෙන් පෙන්වා ඇති අතර ඩයි වර්ග දෙකම අඩංගු සමස්ථයන් හා සම්බන්ධ හරස් සහසම්බන්ධතා (CC) වක්‍ර දම් පාටින් පෙන්වා ඇත.AC වක්‍ර මගින් ලේබල් කරන ලද මොනොමරික් සහ සමූහගත ප්‍රෝටීන් විශේෂ පවතින බව පිළිබිඹු කරන අතර CC වක්‍ර මගින් පෙන්නුම් කරන්නේ ද්විත්ව ලේබල් කළ සමූහවල විසරණය පමණි.එකම විශ්ලේෂණය, නමුත් හුදකලා ස්ථානවල මෙන් එකම විසඳුම් කොන්දේසි යටතේ, මොනොමරික් αS සහ Tau441 පමණක් අඩංගු සාම්පල දකුණු පුවරුවේ පාලනයන් ලෙස පෙන්වයි.c αS/Tau441 විද්‍යුත් ස්ථිතික coacervates තුළ පිහිටුවා ඇති හුදකලා සමස්ථවල තනි අණු වල ප්‍රතිදීප්ත ෆ්ලෑෂ් විශ්ලේෂණය.විවිධ පුනරාවර්තන හතරකින් (N = 152) සොයා ගන්නා සෑම එකතුවක් සඳහාම තොරතුරු ඒවායේ ස්ටෝචියෝමිතිය, S අගයන් සහ FRET කාර්යක්ෂමතාවයට එරෙහිව සැලසුම් කර ඇත (ඉහළ පුවරුව, වර්ණ තීරුව සිදුවීම පිළිබිඹු කරයි).සමස්ථ වර්ග තුනක් වෙන්කර හඳුනාගත හැක: -αS-පමණක් S~1 සහ FRET~0 සමග සමස්ථ, Tau-පමණක් S~0 සහ FRET~1 සමග සමස්ථ, සහ අතරමැදි S සහ FRET ඇස්තමේන්තු සහිත විෂම Tau/αS සමස්ථයන් එක් එක් විෂම සමස්ථය (N = 100) තුළ හඳුනාගත් සලකුණු ප්‍රෝටීන දෙකෙහිම පහළ පුවරුවේ පෙන්වා ඇත (වර්ණ පරිමාණය සිදුවීම පිළිබිඹු කරයි).අමු දත්ත අමු දත්ත ගොනු ආකාරයෙන් සපයනු ලැබේ.
ද්‍රව ප්‍රෝටීන වල කල් පිරීම හෝ වයසට යෑම ජෙල් වැනි හෝ ඝන ව්‍යුහයන් බවට පත් වීම, ඇමයිලොයිඩ් සමුච්චය 7, 48, 49 ට පෙර අසාමාන්‍ය ක්‍රියාවලියක් ලෙස ඝනීභවනයේ භෞතික විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් කිහිපයකට මෙන්ම රෝග වලට සම්බන්ධ වන බව වාර්තා වේ. අපි අදියර වෙන් කිරීම සහ හැසිරීම විස්තරාත්මකව අධ්යයනය කරමු.LPS හි සාමාන්‍ය තාපගතිකව ධාවනය වන හැසිරීම් අනුගමනය කරමින්, අඩු මයික්‍රොමෝලර් සාන්ද්‍රණයන් සහ කායික විද්‍යාත්මකව අදාළ තත්ත්‍වයේ දී පාලිත පරිසරයක සසම්භාවී බහුකාරකයන් ඉදිරියේ LSPT αS (αS හි ගණනය කළ කායික සාන්ද්‍රණය >1 µM50 බව සලකන්න).භෞතික විද්‍යාත්මක pH අගයේ අධික සෘණ ආරෝපිත C-පර්යන්ත කලාපයක් අඩංගු αS, විද්‍යුත් ස්ථිතික ක්‍රියාවලිය හරහා pLK හෝ Tau වැනි අධික කැටානික අක්‍රමිකතා සහිත පෙප්ටයිඩ හමුවේ LLPS හරහා ජලීය ද්‍රාවණයක ප්‍රෝටීන් බහුල ජල බිඳිති සෑදීමට සමත් බව අපට පෙනී ගියේය. සමුච්චිත සාර්ව අණු ඉදිරියේ සංකීර්ණ ඝනීභවනය.මෙම ක්‍රියාවලිය සෛලීය පරිසරයේ අදාළ බලපෑම් ඇති කළ හැකි අතර එහිදී αS හට එහි රෝග ආශ්‍රිත එකතු කිරීම් හා සම්බන්ධ විවිධ බහුකාරක අණු vitro සහ vivo51,52,53,54 යන දෙකෙහිම හමු වේ.
බොහෝ අධ්‍යයනයන්හිදී, ජල බිඳිති තුළ ඇති ප්‍රෝටීන් ගතිකතාවය මේරීමේ ක්‍රියාවලිය තීරණය කරන ප්‍රධාන සාධකයක් ලෙස සලකනු ලැබේ55,56.බහුඅවයවික සමග විද්‍යුත් ස්ථිතික αS coacervates වලදී, මේරීමේ ක්‍රියාවලිය පැහැදිලිවම රඳා පවතින්නේ බහුඅවයව සමඟ අන්තර්ක්‍රියා වල ශක්තිය, සංයුජතාව සහ මෙම අන්තර්ක්‍රියා වල ගුණත්වය මත ය.සමතුලිත න්‍යාය යෝජනා කරන්නේ ද්‍රව තත්වයන් දෙකක සමතුලිත භූ දර්ශනයක් LLPS57,58 ධාවනය කරන ජෛව බහු අවයවික වලින් පොහොසත් විශාල ජල බිඳුවක් තිබීමයි.බිංදු වර්ධනය Ostwald maturation59, coalescence60 හෝ විසුරුවා හරින ලද අදියර61 හි නිදහස් මොනෝමර් පරිභෝජනය මගින් ලබා ගත හැක.αS සහ Tau441, ΔNt-Tau හෝ pLK සඳහා, මෙම අධ්‍යයනයේදී භාවිතා කරන ලද කොන්දේසි යටතේ බොහෝ ප්‍රෝටීන් ඝනීභවනය තුළ සංකේන්ද්‍රණය වී ඇත.කෙසේ වෙතත්, සම්පූර්ණ ප්‍රමාණයේ tau ජල බිඳිති මතුපිට තෙත් කිරීමේදී ශීඝ්‍රයෙන් එකමුතු වන අතර, ජල බිඳිති එකලස් කිරීම සහ තෙත් කිරීම ΔNt-Tau සහ pLK සඳහා දුෂ්කර වූ අතර, මෙම පද්ධති දෙකෙහි ද්‍රව ගුණයන් සීඝ්‍රයෙන් නැති වී යාමක් යෝජනා කරයි.අපගේ FLIM-FRET විශ්ලේෂණයට අනුව, වයස්ගත pLK සහ ΔNt-Tau ජල බිඳිති මුල් ජල බිඳිති හා සමාන ප්‍රෝටීන් සමුච්චයක් (සමාන ප්‍රතිදීප්ත ආයු කාලය) පෙන්නුම් කළ අතර, මුල් ප්‍රෝටීන් ජාලය වඩාත් දෘඩ වුවත් රඳවාගෙන ඇති බව යෝජනා කරයි.
අපි පහත ආකෘතියෙන් අපගේ පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵල තාර්කික කරන්නෙමු (රූපය 8).මුලින් තාවකාලිකව පිහිටුවන ලද ජල බිඳිති බොහෝ විට විද්‍යුත් ස්ථිතික වන්දියක් නොමැතිව ප්‍රෝටීන් ජාල වන අතර, එබැවින් ආරෝපණ අසමතුලිතතාවයේ ප්‍රදේශ ඇත, විශේෂයෙන් ජල බිඳිති අතුරුමුහුණතෙහි, ඉහළ විද්‍යුත් ස්ථිතික මතුපිට විභවයක් සහිත ජල බිඳිති ඇති වේ.ආරෝපණය (සාමාන්‍යයෙන් සංයුජතා ක්ෂය වීම ලෙස හඳුන්වන සංසිද්ධියක්) සහ ජල බිඳිතිවල මතුපිට විභවය අවම කිරීම සඳහා, ජල බිඳිතිවලට තනුක අවධියේ සිට නව පොලිපෙප්ටයිඩ ඇතුළත් කිරීමට, ආරෝපණ ආරෝපණ අන්තර්ක්‍රියා ප්‍රශස්ත කිරීම සඳහා ප්‍රෝටීන ජාල ප්‍රතිසංවිධානය කිරීමට සහ අනෙකුත් ජල බිඳිති සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කිරීමට හැකිය.පෘෂ්ඨයන් සහිත (තෙත් කිරීම).αS/pLK ජල බිඳිති, ඒවායේ සරල ප්‍රෝටීන් ජාලය (αS සහ pLK අතර විෂම අන්තර්ක්‍රියා පමණක්) සහ ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා සඳහා වැඩි බැඳීමක් හේතුවෙන්, ඝනීභවනයේ ආරෝපණය වඩා ඉක්මනින් සමතුලිත කිරීමට හැකි බව පෙනේ;ඇත්ත වශයෙන්ම, අපි αS/Tau වලට වඩා මුලින් සාදන ලද αS/pLK coacervates වල වේගවත් ප්‍රෝටීන් චාලක නිරීක්ෂණය කළෙමු.සංයුජතා ක්ෂය වීමෙන් පසුව, අන්තර්ක්‍රියා අඩු කාලීන වන අතර ජල බිඳිති ඒවායේ ද්‍රව ගුණ නැති වී අඩු විද්‍යුත් ස්ථිතික පෘෂ්ඨ විභවයක් සහිත (එම නිසා මතුපිට තෙත් කිරීමට නොහැකි) ජෙල් වැනි ගිනි නොගන්නා ජල බිඳිති බවට පත් වේ.ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, αS/Tau ජල බිඳිති වඩාත් සංකීර්ණ ප්‍රෝටීන ජාල (සමලිංගික සහ විෂම අන්තර්ක්‍රියා යන දෙකම සමඟ) සහ ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා වල දුර්වල ස්වභාවය හේතුවෙන් බිංදු ආරෝපණ ශේෂය ප්‍රශස්ත කිරීමට අඩු කාර්යක්ෂම වේ.මෙහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස දිය බිංදු දිගු කාලයක් සඳහා ද්‍රව හැසිරීම රඳවා තබා ගන්නා සහ ඉහළ විද්‍යුත් ස්ථිතික මතුපිට විභවයක් පෙන්නුම් කරන අතර එය එකලස් කිරීම සහ වර්ධනය වීම (එමගින් ජල බිඳිතිවල මතුපිට ප්‍රමාණය/පරිමා අනුපාතය අවම කිරීම) සහ ජලාකර්ෂණීය මතුපිට රසායනය තෙත් කිරීම මගින් අවම කිරීමට නැඹුරු වේ.මෙය ප්‍රෝටීන් ජාලයේ ආරෝපණ ප්‍රශස්තිකරණය සඳහා නිරන්තර සෙවීම් හේතුවෙන් අන්තර්ක්‍රියා ඉතා සංක්‍රාන්තිව පවතින බැවින් තරල ගුණ රඳවා තබා ගන්නා විශාල සාන්ද්‍රිත ප්‍රෝටීන් පුස්තකාල නිර්මාණය කරයි.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, ස්වභාවිකව ඇති සමහර සමස්ථානික 62 ඇතුළුව, N-පර්යන්ත ලෙස කපා දැමූ Tau ආකාර අතරමැදි හැසිරීම් ප්‍රදර්ශනය කරයි, සමහර coacervates αS සමඟ වයස්ගත වීම දිගුකාලීන ජෙල් වැනි ජල බිඳිති බවට පත් වන අතර අනෙක් ඒවා විශාල ද්‍රව ඝනීභවනය බවට පරිවර්තනය වේ.αS විද්‍යුත් ස්ථිතික කෝසර්වේට් වල පරිණතභාවයේ මෙම ද්විත්ව භාවය සංයුජතා ක්ෂය වීම සහ සංයුජතා ක්ෂය වීම සහ සංයුජතා විද්‍යුත් ස්ථිතික පෙරීම අතර සහසම්බන්ධයක් හඳුනාගෙන ඇති මෑත කාලීන LLPS න්‍යායික හා පර්යේෂණාත්මක අධ්‍යයනයන්ට අනුකූල වේ.යාන්ත්රණය 58.61.
මෙම යෝජනා ක්‍රමය එල්එල්පීඑස් සහ එල්එස්පීටී හරහා αS සහ Tau441 සඳහා වූ ඇමිලොයිඩ් එකතු කිරීමේ මාර්ගය පෙන්වයි.අතිරේක ඇනායන-පොහොසත් (රතු) සහ කැටායන බහුල (නිල්) කලාප සමඟ, සතුටුදායක සංයුජතා සහිත αS සහ tau විද්‍යුත් ස්ථිතික coacervates අඩු පෘෂ්ඨීය ශක්තියක් ඇති අතර එම නිසා අඩු සංයෝජන ඇති අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ශීඝ්‍ර ජල බිඳිති වයසට යෑම සිදුවේ.ස්ථායී නොවන සමූහගත නොවන ජෙල් තත්වයක් ලබා ගනී..αS/pLK පද්ධතිය සම්බන්ධයෙන් මෙම තත්ත්වය ඉතා වාසිදායක වන්නේ එහි ඉහළ බැඳීම සහ සරල ප්‍රෝටීන් යුගල අන්තර්ක්‍රියා ජාලය නිසා වේගවත් ජෙල් වැනි සංක්‍රාන්තියක් සඳහා ඉඩ සලසයි.ඊට පටහැනිව, අසතුටුදායක සංයුජතා සහිත ජල බිඳිති සහ, එම නිසා, අන්තර්ක්‍රියා සඳහා පවතින ප්‍රෝටීන් ආරෝපිත කලාප, එහි ඉහළ පෘෂ්ඨ ශක්තිය අඩු කිරීම සඳහා කෝසර්වේට් ජලාකර්ෂණීය පෘෂ්ඨය විලයනය කිරීම සහ තෙත් කිරීම පහසු කරයි.දුර්වල Tau-Tau සහ αS-Tau අන්තර්ක්‍රියා වලින් සමන්විත බහුසංයුජ සංකීර්ණ ජාලයක් ඇති αS/Tau441 coacervates සඳහා මෙම තත්ත්වය වඩාත් සුදුසු වේ.අනෙක් අතට, විශාල coacervates ඔවුන්ගේ තරල වැනි ගුණාංග වඩාත් පහසුවෙන් රඳවා තබා ගනී, වෙනත් ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා සිදු වීමට ඉඩ සලසයි.අවසානයේදී, කෝසර්වේට් තරලය තුළ αS සහ tau යන දෙකම අඩංගු ඇමයිලොයිඩ් විෂමජාතීය සමූහ සාදයි, ඒවා ස්නායු විකෘතිතා රෝගවල ලක්ෂණ වන ඇතුළත් ශරීරවල ඇති ඒවාට සම්බන්ධ විය හැකිය.
αS/Tau441 පරිණත වීමේදී සෑදෙන විශාල ද්‍රව වැනි ව්‍යුහයන් අධික තදබදයක් ඇති නමුත් ගතික ප්‍රෝටීන් පරිසරයක් සහ අඩු ප්‍රමාණයකට αS/ΔNt-Tau coacervates ප්‍රෝටීන් සමුච්චය න්‍යෂ්ටිකකරණය සඳහා කදිම ජලාශ වේ.බොහෝ විට αS සහ tau යන දෙකම අඩංගු මෙම වර්ගයේ ප්‍රෝටීන් කෝසර්වේට් වල ඝන ප්‍රෝටීන් සමූහ සෑදීම අපි ඇත්ත වශයෙන්ම නිරීක්ෂණය කර ඇත්තෙමු.මෙම විෂම සමූහයන් විද්‍යුත් ස්ථිතික නොවන අන්තර්ක්‍රියා මගින් ස්ථායී වන බවත්, සාමාන්‍ය ඇමයිලොයිඩ් ෆයිබ්‍රිල් මෙන් ඇමයිලොයිඩ්-විශේෂිත ThT සායම් බැඳීමට හැකි බවත්, ඇත්ත වශයෙන්ම විවිධ බලපෑම්වලට සමාන ප්‍රතිරෝධයක් ඇති බවත් අපි පෙන්වා දී ඇත්තෙමු.LLPS විසින් සාදන ලද αS/tau සමස්ථයන් ඇමයිලොයිඩ්-සමාන ගුණ ඇති බව පෙන්නුම් කරන ලදී.ඇත්ත වශයෙන්ම, ඇමයිලොයිඩ් සමුච්චයේ ඇති ටෝ හි පරිණත ප්‍රභේදය ද්‍රව විද්‍යුත් ස්ථිතික කෝසර්වේට් තුළ මෙම විෂමජාතීය αS සමස්ථයන් සෑදීමේදී සැලකිය යුතු ලෙස දුර්වල වේ.αS/Tau441 සමස්ථයන් සෑදීම නිරීක්ෂණය කරන ලද්දේ coacervates තුළ පමණක් වන අතර, එය ද්‍රව-සමාන ගුණ රඳවා තබා ගන්නා අතර, coacervates/droplets ජෙල් තත්වයට නොපැමිණියේ නම්, කිසි විටෙකත් සිදු නොවේ.අවසාන අවස්ථාවේ දී, විද්‍යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්‍රියා වල ශක්තිය වැඩි වීම සහ එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ප්‍රෝටීන් ජාලයේ දෘඪතාව ඇමයිලොයිඩ් න්‍යෂ්ටිය සඳහා අවශ්‍ය නව ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා ස්ථාපිත කිරීම සඳහා ප්‍රෝටීනවල අවශ්‍ය අනුරූප ප්‍රතිසංවිධානය වළක්වයි.කෙසේ වෙතත්, මෙය වඩාත් නම්‍යශීලී, ද්‍රව-සමාන කෝසර්වේට් වලින් සාක්ෂාත් කර ගත හැකි අතර, ඒවා ප්‍රමාණයෙන් වැඩි වන විට ද්‍රව ලෙස පවතිනු ඇත.
විශාල αS/Tau ඝනීභවනයක දී ඝනීභවනය වූ අවධිය තුළ සමස්ථයන් සෑදීම ශීඝ්‍රයෙන් ජෙල් වන කුඩා ජල බිඳිතිවලට වඩා යෝග්‍ය බව, ජල බිඳිති ඒකාබද්ධතාව පාලනය කරන සාධක හඳුනාගැනීමේ අදාළත්වය ඉස්මතු කරයි.මේ අනුව, අදියර වෙන් කිරීමේ ප්රවණතාවයක් පමණක් නොව, නිසි ක්රියාකාරීත්වය සඳහා මෙන්ම රෝග වැළැක්වීම58,61 සඳහා ඝනීභවනයේ ප්රමාණය පාලනය කළ යුතුය.අපගේ ප්‍රතිඵල මගින් αS/Tau පද්ධතිය සඳහා LLPS සහ LSPT අතර සමතුලිතතාවයේ වැදගත්කම ද ඉස්මතු කරයි.අනෙකුත් පද්ධති 63,64 හි යෝජනා කර ඇති පරිදි, සංතෘප්ත තත්ත්‍වයන් යටතේ ලබා ගත හැකි ප්‍රෝටීන් මොනෝමර් ප්‍රමාණය අඩු කිරීමෙන් ජල බිඳිති සෑදීම ඇමයිලොයිඩ් සමුච්චයෙන් ආරක්ෂා විය හැකි අතර, ඉහළ ජල බිඳිති මට්ටම්වල ජල බිඳිති විලයනය මන්දගාමී අනුරූප ප්‍රතිසංවිධානය හරහා අභ්‍යන්තර ප්‍රෝටීන් සමුච්චය වීමට හේතු විය හැක.ප්රෝටීන් ජාල..
සමස්තයක් වශයෙන්, අපගේ දත්ත LSPT හි සන්දර්භය තුළ ඩ්‍රොප් ජාලයන්හි සමෝධානික සංයුජතාව සහ තෘප්තිමත්/අතෘප්තිමත් අන්තර්ක්‍රියා වල අදාළත්වය දැඩි ලෙස අවධාරණය කරයි.විශේෂයෙන්ම, සම්පූර්ණ දිග αS/Tau441 ඝනීභවනයට ප්‍රෝටීන දෙකම ඇතුළත් වන ඇමයිලොයිඩ් වැනි විෂම සමූහයන් සෑදීමට කාර්යක්ෂමව විලයනය කිරීමට සහ න්‍යෂ්ටික කිරීමට හැකි බව අපි පෙන්වා දෙන අතර අපගේ පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵල මත පදනම්ව අණුක යාන්ත්‍රණයක් යෝජනා කරමු.අප මෙහි වාර්තා කරන αS/Tau තරල coacervate හි ඇති ප්‍රෝටීන දෙකක සම-එකතු කිරීම ඇත්ත වශයෙන්ම ඇතුළත් කිරීම් වල ප්‍රෝටීන දෙකක සම-ප්‍රාදේශීයකරණයට සම්බන්ධ විය හැකි අතර ඒවා රෝගයේ ලක්ෂණ වන අතර LLPS සහ LLPS අතර සම්බන්ධතාවය අවබෝධ කර ගැනීමට දායක විය හැකිය. ඇමයිලොයිඩ් සමුච්චය කිරීම, ස්නායු පරිහානියේදී අධික ලෙස ආරෝපිත IDP සඳහා මග පාදයි.
Monomeric WT-αS, cysteine ​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) සහ ΔCt-αS ප්‍රභේද (Δ101-140) E. coli හි ප්‍රකාශ කර පෙර විස්තර කර ඇති පරිදි පිරිසිදු කර ඇත.ඩයිසල්ෆයිඩ් බන්ධන සෑදීම වැලැක්වීම සඳහා αS cysteine ​​mutants පිරිසිදු කිරීමේ සියලුම පියවර සඳහා 5 mM DTT ඇතුළත් කර ඇත.Tau441 isoform (Addgene #16316 වෙතින් ලබාගත් ප්ලාස්මිඩ්), ΔNt-Tau ප්‍රභේදය (Δ1–150, ප්‍රාථමික CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACGCGG, CATGTATATCCTCTCTTCTTAAGCGG, CATGTATATCCTCTCTTCTTAAGGG, CATGTATATCCTCTCTTTAAGTAA1-Pur2,AggDAef1,20000 GGCTC5 ප්‍රාථමිකය සමඟින් සකස් කර ඇත) E. coli සංස්කෘතීන් විය 37 ° C සහ 180 rpm දී OD600 = 0.6-0.7 දක්වා වර්ධනය වන අතර, 37 ° C දී පැය 3 ක් සඳහා IPTG සමඟ ප්රකාශනය ප්රේරණය කරන ලදී.4 °C දී විනාඩි 15ක් සඳහා 11,500 xg සෛල අස්වනු නෙලීම සහ 150 mM NaCl අඩංගු සේලයින් බෆරයකින් සෝදා හරින්න.ලයිසිස් බෆරය තුළ පෙති නැවත සවි කරන්න (1 L LB ට 20 ml: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, බෙන්සාමිඩින් 50 μM1, copeptin 50 μM1).ස්පන්දන 10 ක් සඳහා 80% ක විස්තාරයක් සහිත අයිස් මත sonication පියවර සිදු කරන ලදී (මිනිත්තු 1 ක්, විනාඩි 1 ක් අඩුවෙන්).එක් අල්ට්රා සවුන්ඩ් එකක මිලි ලීටර් 60 නොඉක්මවිය යුතුය.E. coli lysates 95° C. විනාඩි 20ක් රත් කර, පසුව අයිස් මත සිසිල් කර විනාඩි 40ක් සඳහා 127,000×g කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී.පැහැදිලි කරන ලද සුපර්නැටන්ට් 3.5 kDa පටලයකට (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) යොදන ලද අතර ඩයලිසිස් බෆරයේ L 4 ට (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 m2 mM, DTT, MgMCl2 , PMSF 0.1 mM) පැය 10 ක් සඳහා.5 ml කැටායන හුවමාරු තීරුවක් (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) සමතුලිතතා බෆරය (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM) සමඟ සමතුලිත විය.tau lysate 0.22 μm PVDF ෆිල්ටරයක් ​​හරහා පෙරන ලද අතර 1 ml / min ප්රවාහ අනුපාතයකින් තීරුව තුලට එන්නත් කරන ලදී.ඉවත් කිරීම ක්‍රමයෙන් සිදු කරන ලදී, 15-30% elution buffer (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) සමඟ tau ඉවත් කරන ලදී.භාග SDS-PAGE මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලද අතර, 10 kDa කේන්ද්‍රාපසාරී ෆිල්ටරයක් ​​භාවිතයෙන් tau හි අපේක්ෂිත අණුක බර සහිත එක් කලාපයක් අඩංගු ඕනෑම භාග සාන්ද්‍රණය කර 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM සහ DTT 2 mM අඩංගු බෆරයක් සමඟ ප්‍රතිස්ථාපනය කරන ලදී. අවසාන ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණය 100 μM විය.එවිට ප්‍රෝටීන් ද්‍රාවණය 0.22 μm PVDF ෆිල්ටරයක් ​​හරහා ඉක්මනින් ශීත කළ අතර -80 ° C දී ගබඩා කර ඇත.Protein K18 කාරුණිකව සපයන ලද්දේ මහාචාර්ය ඇල්බර්ටෝ බොෆි විසිනි.SDS-PAGE සහ MALDI-TOF/TOF මගින් තහවුරු කරන ලද පරිදි සකස් කිරීමේ සංශුද්ධතාවය >95% විය.විවිධ සිස්ටීන් රසායනිකව AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) හෝ TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada) සමඟින් ලේබල් කර ඇත.අවශෝෂණය සහ MALDI-TOF/TOF මගින් තහවුරු කරන ලදී.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau සහ K18 එම ක්‍රියා පටිපාටියම අනුගමනය කරමින් Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) භාවිතයෙන් 191 සහ 322 ස්ථානවල දේශීය සිස්ටීන් අපද්‍රව්‍ය සමඟ ලේබල් කර ඇත.αS සහ Tau441 සඳහා අවශේෂ සිතියම් සඳහා ශුද්ධ ගාස්තුව CIDER66 භාවිතයෙන් ජනනය කරන ලදී.
Solid poly-L-lysine (pLK DP 90-110 සැපයුම්කරු වෙතින් NMR අනුව, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 සිට 10 mM ක්‍රියාවලි sonicated සාන්ද්‍රණය, මිනිත්තු අතිධ්වනික ජල ස්නානයක තබා -20 ° C දී ගබඩා කරන්න.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) සහ FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) ජලයේ ද්‍රාව්‍ය වන අතර LLPS බෆරයේ බහුලව බෙදා හරිනු ලැබේ.ඩයලිසිස් මගින් දූෂිත ලවණ ඉවත් කරයි.ඉන්පසු ඒවා 0.22 μm සිදුරු ප්‍රමාණයකින් යුත් සිරින්ජ පෙරහනක් හරහා පෙරන ලද අතර ඒවායේ සාන්ද්‍රණය වර්තනමානයක් (මෙට්ලර් ටොලෙඩෝ, කොලොම්බස්, ඔහියෝ, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය) භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලදී.පහත දැක්වෙන අනුපිළිවෙලින් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී LLPS සාම්පල සකස් කරන ලදී: බෆරය සහ නිස්සාරණය මිශ්‍ර කරන ලද අතර 1 mM ට්‍රයිස් (2-කාබොක්සයිතයිල්) ෆොස්ෆයින් (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(ඊතේන්- 1, 2-ඩයිල්ඩිනයිට්‍රයිල්) ටෙට්‍රාඇසිටික් අම්ලය (EDTA, carboxynth) සහ 1% ප්‍රෝටීස් නිෂේධක මිශ්‍රණයක් (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).ඉන්පසුව αS සහ විලයන ලද පොලිකේෂන් (විකල්ප pLK හෝ Tau) එකතු වේ.thioflavin-T කාල ශ්‍රේණියේ අත්හදා බැලීම් සඳහා (ThT, Carbosynth, Compton, UK), සම්පූර්ණ ThT සාන්ද්‍රණය αS සාන්ද්‍රණයෙන් අඩක් වීමට භාවිතා කරන්න.සාම්පල සමජාතීය බව සහතික කිරීම සඳහා මෘදු නමුත් තරයේ මිශ්ර කරන්න.ප්‍රතිඵල කොටසේ විස්තර කර ඇති පරිදි එක් එක් සංරචකයේ සාන්ද්‍රණය අත්හදා බැලීමෙන් අත්හදා බැලීම්වලට වෙනස් විය.අත්හදා බැලීමේ කාලය පැය 4 ඉක්මවන සෑම අවස්ථාවකම Azide 0.02% (w/v) සාන්ද්‍රණයකින් භාවිතා කරන ලදී.LLPS සාම්පල භාවිතා කරන සියලුම විශ්ලේෂණ සඳහා, විශ්ලේෂණයට පෙර මිනිත්තු 5ක් මිශ්‍රණය සමතුලිත වීමට ඉඩ දෙන්න.ආලෝක විසිරුම් විශ්ලේෂණය සඳහා, සාම්පල 150 µl බන්ධන නොවන ළිං 96 ක්ෂුද්‍ර තහඩු (µClear®, black, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) මත පටවා ඇලවුම් පටලයකින් ආවරණය කරන ලදී.CLARIOstar තහඩු කියවනයක (BMG Labtech, Ortenberg, Germany) ද්‍රාවණයේ මධ්‍යයේ 350 nm හි අවශෝෂණය මැනීම මගින් LLPs නිරීක්ෂණය කරන ලදී.අත්හදා බැලීම් 25 ° C දී තුන් ගුණයකින් සිදු කරන ලද අතර, දෝෂයන් මධ්යන්යයෙන් සම්මත අපගමනය ලෙස ගණනය කරන ලදී.නියැදි කේන්ද්‍රාපසාරී සහ SDS-PAGE ජෙල් විශ්ලේෂණය මගින් තනුක අවධිය ප්‍රමාණනය කරන ලද අතර, තනුක සහ සාන්ද්‍රිත අවධිවල αS භාගය විවිධ LLPS විසඳුම් තුළ ප්‍රමාණනය කරන ලදී.1 μm AF488-ලේබල් කරන ලද αS අඩංගු 100 μl LLPS සාම්පලයක් හොඳින් මිශ්‍ර කර විනාඩි 30ක් 9600×g දී කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීමෙන් පසුව සාමාන්‍යයෙන් වර්ෂාපතනය දෘශ්‍යමාන විය.SDS-PAGE ජෙල් භාවිතයෙන් ප්‍රෝටීන් ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා සුපිරි 50 μl භාවිතා කරන ලදී.ChemiDoc ජෙල් රූපකරණ පද්ධතියක් (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) භාවිතයෙන් AF488 ෆිල්ටර සමඟ ජෙල් ස්කෑන් කරන ලදී හෝ Coomassie පැල්ලමකින් පැල්ලම් කර සුදුසු පෙරහන් සමඟ දෘශ්‍යමාන කරන ලදී.මෙහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ලබාගත් පටි ImageJ අනුවාදය 1.53i (National Institutes of Health, USA) භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.සමාන ප්‍රතිඵල සහිත විවිධ අත්හදා බැලීම් දෙකක දී අත්හදා බැලීම් අනුපිටපත්වල සිදු කරන ලදී.
සාමාන්‍යයෙන්, සාම්පල 150 μl බන්ධනය නොවන ළිං 96 ක්ෂුද්‍ර තහඩු සඳහා යොදන ලද අතර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී Leica DMI6000B ප්‍රතිලෝම අන්වීක්ෂයකින් (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) දර්ශනය විය.ස්ථානීය පරීක්ෂණ සඳහා, µ-Slide Angiogenesis තහඩු (Ibidi GmbH, Gräfelfing, ජර්මනිය) හෝ 96-ළිං ෙපොලිස්ටිරින් මයික්‍රොප්ලේට් (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ද භාවිතා කරන ලදී.EL6000 හැලජන් හෝ රසදිය ලෝහ හේලයිඩ ලාම්පු ආලෝකකරණ ප්‍රභවයන් ලෙස භාවිතා කරන ලදී (පිළිවෙලින් BF/DIC සහ WF රූපකරණය සඳහා).WF අන්වීක්ෂය සඳහා, නියැදිය මත ආලෝකය නාභිගත කර එය එකතු කිරීමට 40x විශාලන වායු අරමුණක් (Leica Microsystems, Germany) භාවිතා කරන ලදී.AF488 සහ ThT ලේබල් කරන ලද සාම්පල සඳහා, සම්මත GFP පෙරහන් කට්ටල සමඟ පෙරහන් උද්දීපනය සහ විමෝචනය, උද්දීපනය සහ විමෝචන බෑන්ඩ්පාස් පෙරහන්, පිළිවෙලින්, 460-500 nm සහ 512-542 nm bandpass ෆිල්ටර්, සහ 495 nm dichroic mirror.Atto647N සමඟ ලේබල් කර ඇති සාම්පල සඳහා, උද්දීපනය සහ විමෝචන බෑන්ඩ්පාස් ෆිල්ටර් 628-40 nm සහ 692-40 nm සහිත සම්මත Cy5 ෆිල්ටර් කට්ටලයක් සහ 660 nm dichroic කණ්ණාඩියක් භාවිතා කරන ලදී.BF සහ DIC අන්වීක්ෂය සඳහා, එකම පරාවර්තක ආලෝක එකතු කිරීමේ අරමුණ භාවිතා කරන්න.එකතු කරන ලද ආලෝකය Leica DFC7000 CCD කැමරාවක (Leica Microsystems, Germany) පටිගත විය.නිරාවරණ කාලය BF සහ DIC අන්වීක්ෂ රූප සඳහා 50 ms සහ WF අන්වීක්ෂ රූප සඳහා 20-100 ms විය.සංසන්දනය කිරීම සඳහා, ThT සමඟ සියලු අත්හදා බැලීම් සඳහා නිරාවරණ කාලය 100 ms විය.මිනිත්තු කිහිපයක් සඳහා සෑම 100 ms 100 කට වරක් පින්තූර එකතු කිරීමත් සමඟ, ජල බිඳිති ඒකාබද්ධ කිරීම දෘශ්‍යමාන කිරීම සඳහා කාල පරික්ෂණ අත්හදා බැලීම් සිදු කරන ලදී.ImageJ (NIH, USA) රූප විශ්ලේෂණය සඳහා භාවිතා කරන ලදී.ඒ හා සමාන ප්‍රතිඵල සහිතව අත්හදා බැලීම් තුන් ගුණයකින් සිදු කරන ලදී.
Colocalization පරීක්ෂණ, FRAP සහ 3D ප්‍රතිනිර්මාණය සඳහා, ZEN 2 නිල් සංස්කරණයක් (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) භාවිතා කරමින් Zeiss LSM 880 ප්‍රතිලෝම confocal අන්වීක්ෂයකින් පින්තූර ලබා ගන්නා ලදී.µ-Slide Angiogenesis Petri ඩිෂ් (Ibidi GmbH, Gröfelfing, ජර්මනිය) සඳහා 50 µl සාම්පල යොදන ලදී, හයිඩ්‍රොෆිලික් බහුඅවයවයකින් (ibiTreat) ප්‍රතිකාර කර 63× තෙල් ගිල්වීමේ අරමුණකින් (Plan-Apochromat 1.4/il NA) සවි කර ඇත. DIC මත).458 nm, 488 nm, සහ 633 nm ආගන් ලේසර් රේඛා 0.26 µm/පික්සල විභේදනයකින් සහ 470-600 nm, 840 nm, 620-600 nm, විමෝචනය හඳුනාගැනීමේ කවුළු සඳහා නිරාවරණ කාලය 8 µs/පික්සල භාවිතා කරමින් පින්තූර ලබා ගන්නා ලදී. සහ පිළිවෙලින් ThT, AF488 සහ Atto647N දෘශ්‍යමාන කිරීමට 638-755 nm භාවිතා කරන ලදී.FRAP අත්හදා බැලීම් සඳහා, එක් එක් නියැදියක කාලානුරූපී ඡායාරූප ගත කිරීම තත්පරයකට රාමු 1 බැගින් වාර්තා කරන ලදී.අත්හදා බැලීම් සමාන ප්‍රතිඵල සහිතව කාමර උෂ්ණත්වයේ දී තුන් ගුණයකින් සිදු කරන ලදී.සියලුම පින්තූර Zen 2 නිල් සංස්කරණ මෘදුකාංග (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.FRAP වක්‍ර සාමාන්‍යකරණය කර, සැලසුම් කර, OriginPro 9.1 භාවිතයෙන් Zen 2 භාවිතයෙන් රූපවලින් උපුටා ගත් තීව්‍රතා/කාල දත්තවලට සවි කර ඇත.අත්පත් කර ගැනීමේ විරංජන ආචරණය සඳහා අතිරේක ඝාතීය පදයක් සමඟ අණුක විසරණය සඳහා ගිණුම් කිරීම සඳහා ප්‍රතිසාධන වක්‍ර ඒකපුද්ගලික ආකෘතියකට සවි කර ඇත.අපි පසුව Kang et al සමීකරණයේ දී නාමික විරංජන අරය සහ කලින් තීරණය කළ ප්‍රතිසාධන අර්ධ ආයු කාලය භාවිතයෙන් D ගණනය කළෙමු.5 35 පෙන්වා ඇත.
αS හි තනි සිස්ටීන් ප්‍රභේද 4-හයිඩ්‍රොක්සි-2,2,6,6-ටෙට්‍රාමෙතිල්පිපෙරිඩින්-එන්-ඔක්සිල් (TEMPOL) සමඟ 24 (TEMPOL-24-αS) සහ 122 (TEMPOL-122-αS) ස්ථානවල සංස්ලේෂණය කරන ලදී. පිළිවෙලින්.ස්පින් ලේබල් කිරීම EPR පරීක්ෂණ සඳහා, αS සාන්ද්‍රණය 100 μM ලෙස සකසා ඇති අතර PEG සාන්ද්‍රණය 15% (w/v) විය.විවිධ එකතු කිරීමේ කොන්දේසි සඳහා, αS:pLK අනුපාතය 1:10 වූ අතර, αS:ΔNt-Tau සහ αS:Tau441 අනුපාත 1:1 ලෙස පවත්වා ගෙන යන ලදී.ජනාකීර්ණ නොමැති තතු තුල බන්ධන ටයිටේෂන් අත්හදා බැලීම් සඳහා, TEMPOL-122-αS 50 μM හි පවත්වා ගෙන යන අතර, එක් එක් කොන්දේසි වෙන වෙනම සකස් කරමින් සාන්ද්‍රණය වැඩි කිරීමේදී පොලිකේෂන් ටයිටේට් කරන ලදී.CW-EPR මිනුම් සිදු කරන ලද්දේ Bruker ELEXSYS E580 X-band spectrometer භාවිතා කර Bruker ER4118 SPT-N1 අනුනාදකයක් ~9.7 GHz මයික්‍රෝවේව් (SHF) සංඛ්‍යාතයකින් ක්‍රියාත්මක වේ.උෂ්ණත්වය සෙල්සියස් අංශක 25 ට සකසා දියර නයිට්‍රජන් ක්‍රියෝස්ටැට් මගින් පාලනය වේ.වර්ණාවලි අසංතෘප්ත තත්ව යටතේ මෙගාවොට් 4 ක බලයක්, මොඩියුලේෂන් විස්තාරය 0.1 mT සහ 100 kHz මොඩියුලේෂන් සංඛ්‍යාතයක් යටතේ ලබා ගන්නා ලදී.Tau441 හෝ ΔNt-Tau (මුල් ප්‍රෝටීන් ද්‍රාවණවල පවතින) අඩංගු සාම්පලවල අවශේෂ සාන්ද්‍රණය අඩු කිරීමේ නියෝජිතයන් නිසා සාම්පල අතර භ්‍රමණ සාන්ද්‍රණයේ වෙනස්කම් සහ භ්‍රමණය අඩු වීම වළක්වා ගැනීමට වර්ණාවලි තීව්‍රතාව සාමාන්‍යකරණය කරන ලදී.G හි දී ඇති අගයන් Matlab®67 හි ක්‍රියාත්මක කරන ලද Easyspin මෘදුකාංගය (v. 6.0.0-dev.34) භාවිතයෙන් සිදු කරන ලද EPR වර්ණාවලි ආකෘති නිර්මාණයේ ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ලබා ගන්නා ලදී.දත්ත ආදර්ශනය කිරීම සඳහා එක්/දෙක සංරචක සමස්ථානික ආකෘති භාවිතා කරන ලදී.සියලුම සංඥා සාමාන්‍යකරණය කිරීමෙන් පසු, එක් එක් අනුකරණය අනුරූප පර්යේෂණ වර්ණාවලියෙන් අඩු කිරීමෙන් අවශේෂ ගණනය කරනු ලැබේ.බන්ධන ටයිටේෂන් විශ්ලේෂණය සඳහා, සාමාන්‍යකරණය කරන ලද EPR වර්ණාවලියේ (IIII/III) දෙවන කලාපයට තුන්වන කලාපයේ සාපේක්ෂ තීව්‍රතාවය αS වෙත පොලිකේෂන් බන්ධනය නිරීක්ෂණය කිරීමට භාවිතා කරන ලදී.විඝටන නියතය (Kd) ඇස්තමේන්තු කිරීම සඳහා, ප්රතිඵලය වන වක්රය n සමාන සහ ස්වාධීන බන්ධන ස්ථාන උපකල්පනය කරමින් ආසන්න ආකෘතියකට සවි කර ඇත.
NMR වර්ණාවලීක්ෂ පරීක්ෂණ Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR වර්ණාවලීක්ෂයක් භාවිතා කර ක්‍රියෝප්‍රෝබ් සහ Z-ශ්‍රේණියකින් සමන්විත විය.10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 හි 130-207 µM αS සහ ඊට අනුරූප αS/ΔNt-Tau සහ pLK සමානතා භාවිතා කරමින් සියලුම අත්හදා බැලීම් සිදු කරන ලද අතර 15 ° C දී සිදු කරන ලදී.NMR මගින් LPS නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා, 10% PEG පෙර-මිශ්‍ර කළ සාම්පලවලට එකතු කරන ලදී.රසායනික මාරු කැළඹීමේ කුමන්ත්‍රණය (රූපය 1b) සාමාන්‍ය 1H සහ 15N රසායනික මාරුවීම් පෙන්වයි.αS 2D1H-15N HSQC වර්ණාවලිය පෙර පැවරුමක් (BMRB ඇතුල්වීම #25227) මත පදනම්ව පවරා ඇති අතර HNCA, HNCO සහ CBCAcoNH හි 3D වර්ණාවලි පටිගත කිරීම සහ විශ්ලේෂණය කිරීම මගින් තහවුරු කරන ලදී.13Cα සහ 13Cβ රසායනික මාරුවීම් ΔNt-Tau හෝ pLK ඉදිරියේ ගණනය කරනු ලැබුවේ පිරිසිදු අහඹු දඟර 68 හි αS රසායනික මාරුවීම්වලට සාපේක්ෂව ද්විතියික ව්‍යුහ ප්‍රවණතාවල ඇති විය හැකි වෙනස්කම් මැනීම සඳහාය (පරිපූරක රූපය 5c).R1ρ අනුපාත 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, සහ 800 ms ප්‍රමාදයන් සමඟ hsqctretf3gpsi අත්හදා බැලීම් (Bruker පුස්තකාලයෙන් ලබා ගන්නා ලද) පටිගත කිරීම මගින් මනිනු ලබන අතර, ඝාතීය ශ්‍රිත විවිධ ප්‍රමාද ප්‍රමාදයන් සඳහා සකසන ලදී. R1ρ සහ එහි පර්යේෂණාත්මක අවිනිශ්චිතතාවය තීරණය කිරීමට කාලය.
කාල-අනුකූල තනි ෆෝටෝන ගණන් කිරීමේ (TCSPC) උපාංගයක් සහිත වාණිජ කාල-විසඳන ලද MT200 fluorescence confocal අන්වීක්ෂයක් (PicoQuant, Berlin, Germany) මත ද්වි-වර්ණ කාල-විසඳන ලද ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂ පරීක්ෂණ සිදු කරන ලදී.ලේසර් ඩයෝඩ හිස ස්පන්දන අන්තර් පත්‍ර උද්දීපනය (PIE) සඳහා භාවිතා කරයි, කදම්භය තනි මාදිලියේ තරංග මාර්ගෝපදේශයක් හරහා ගමන් කරන අතර ඩයික්‍රොයික් දර්පණයකින් පසුව මනිනු ලබන 481 nm සහ 637 nm ලේසර් රේඛා සඳහා 10 සිට 100 nW දක්වා ලේසර් බලයකට සුසර කරනු ලැබේ.මෙය ප්‍රශස්ත ෆෝටෝන ගණන් කිරීමේ අනුපාතයක් සහතික කරයි, ෆෝටෝන අන්වර්ථකරණය, ෆොටෝබ්ලීචිං සහ සන්තෘප්තියේ බලපෑම් වළක්වා ගනී.μ-Slide angiogenesis ආවරණ හෝ තහඩු (Ibidi GmbH, Gräfelfing, ජර්මනිය) නිවැරදි කරපටි සහිත (Olympus Life Sciences, Waltham, USA) Super Apochromat 60x NA 1.2 කාචයක් හරහා ගිල්වීමේ ජලයේ කෙලින්ම තැන්පත් කරන ලදී.488/640 nm dichroic දර්පණයක් (Semrock, Lake Forest, IL, USA) ප්‍රධාන කදම්භ බෙදුම්කරු ලෙස භාවිතා කරන ලදී.නාභිගත නොකළ විකිරණ මයික්‍රෝන 50 ක විෂ්කම්භයක් සහිත සිදුරකින් අවහිර කරනු ලැබේ, පසුව නාභිගත කරන ලද විකිරණ 50/50 කදම්භ බෙදීමකින් හඳුනාගැනීමේ මාර්ග 2 කට බෙදා ඇත.Bandpass විමෝචන පෙරහන් (Semrock, Lake Forest, IL, USA) හරිත සායම් (AF488) සඳහා 520/35 සහ රතු සායම් සඳහා 690/70 (Atto647N) අනාවරකය ඉදිරිපිට භාවිතා කරන ලදී.Single-photon avalanche diodes (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italy) අනාවරක ලෙස භාවිතා කරන ලදී.දත්ත එකතු කිරීම සහ විශ්ලේෂණය යන දෙකම වාණිජමය වශයෙන් පවතින SymfoTime64 මෘදුකාංගය (PicoQuant GmbH, Berlin, Germany) භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී.
μ-Slide angiogenesis ළිං (Ibidi GmbH, Gräfelfing, ජර්මනිය) සඳහා LLPS සාම්පල මයික්‍රොලීටර් පනහක් යොදන ලදී.අත්හිටවූ ජල බිඳිති සඳහා ප්‍රශස්ත වෛෂයික ක්‍රියාකාරී දුරක් සඳහා ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ලැබෙන රූප ළිං පතුලේ සිට 20 µm දක්වාත්, අවම වශයෙන් 0.25 µm/පික්සලයක අක්ෂීය විභේදනයක් සහ 400 µs/පික්සල ප්‍රමාද කාලයක් සහිත පරාල සහ තිත් සඳහා ~1 µm දක්වාත් නාභිගත කර ඇත.එක් එක් නාලිකාව සඳහා සාමාන්‍ය පසුබිම් සංඥා තීව්‍රතාවය (PBG, මධ්‍යන්‍ය + 2σ) මත පදනම්ව තීව්‍රතා එළිපත්තක් යෙදීමෙන් දත්ත තෝරන්න, එවිට ද්‍රව ප්‍රෝටීන් ජල බිඳිති, පරාල හෝ ලප පමණක් තෝරා ගනු ලැබේ, විසුරුවා හරින ලද අවධියෙන් විය හැකි ඕනෑම සම්භවයක් පෙරීම.එක් එක් නාලිකාවේ එක් එක් විශේෂයේ (τ) ආයු කාලය විශ්ලේෂණය කිරීමට (කොළ, AF488 සඳහා “g” සහ රතු, Atto647N සඳහා “r”), අපි ජල බිඳිති, පරාල හෝ ලප අඩංගු උනන්දුවක් දක්වන කලාප (ROIs) තෝරා ගත්තෙමු (පරිපූරක රූපය 1 )8b) සහ එක් එක් නාලිකාවේ වලිගයට ගැළපෙන විශ්ලේෂණයක් සහ ද්වි සංරචක දිරාපත්වීමේ ආකෘතියක් භාවිතා කරමින් ඔවුන්ගේ ජීවිත කාලයෙහි දිරාපත්වීම (පිළිවෙලින් ජල බිඳිති, පරාල හෝ ලප සඳහා τD, τR සහ τP පරිපූරක Fig. 8c බලන්න) සවි කිරීමෙන් ඒවා ව්‍යුත්පන්න කර ඇත.τ සිට සාමාන්‍ය τ .බහු ඝාතීය යෝග්‍යතාවයක් සඳහා ඉතා අඩු ෆෝටෝන නිපදවන ලද ROIs විශ්ලේෂණයෙන් බැහැර කරන ලදී.භාවිතා කරන ලද කැපුම පරාල සහ තිත් සඳහා ෆෝටෝන 104 ක් සහ බිංදු සඳහා 103 ක් විය.රූප ක්ෂේත්‍රයේ ඇති ජල බිඳිති සාමාන්‍යයෙන් කුඩා වන අතර සංඛ්‍යාව අඩු බැවින් වැඩි තීව්‍රතා අගයන් සහිත දිරාපත්වීමේ වක්‍ර ලබා ගැනීම අපහසු බැවින් ජල බිඳිති වලට අඩු එළිපත්තක් ඇත.ෆෝටෝන සමුච්චය සීමාවට වඩා (>500 ගණන්/පික්සල ලෙස සකසා ඇති) ෆෝටෝන ගණන් සහිත ROI ද විශ්ලේෂණය සඳහා ඉවත දමන ලදී.සියලුම තීව්‍රතා ක්ෂයවීම් සඳහාම පවත්වා ගනිමින් අවම IRF මැදිහත්වීමක් සහතික කිරීම සඳහා සේවා කාලය ආරම්භයේ සිට උපරිමයෙන් 90% (දිරාපත්වීමේ උපරිම තීව්‍රතාවයෙන් මඳක් පසුව) තීව්‍රතාවයකින් උනන්දුවක් දක්වන කලාපයෙන් ලබාගත් තීව්‍රතා ක්ෂය වක්‍රය ගළපන්න. සැකසුම් සාපේක්ෂ කාල කවුළුව පරාල සහ ලප සඳහා 25 සිට 50 ROI සහ බිංදු සඳහා 15-25 ROI විශ්ලේෂණය කරන ලදී, අවම වශයෙන් ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් 3 කින් වාර්තා කරන ලද අනුරූ 4 කට වඩා වැඩි ගණනකින් තෝරාගත් පින්තූර.විශේෂ අතර හෝ coacervate පද්ධති අතර සංඛ්‍යානමය වෙනස්කම් ඇගයීම සඳහා ද්වි-වලිග t-පරීක්ෂණ භාවිතා කර ඇත.ආයුකාලය (τ) පික්සලයෙන් පික්සල් විශ්ලේෂණයක් සඳහා, එක් එක් නාලිකාව සඳහා ක්ෂේත්‍රය පුරා ආයුකාලයේ සම්පූර්ණ දුර්වල වීම ගණනය කරන ලද අතර 2/3-සංරචක ඝාතීය දුර්වල කිරීමේ ආකෘතියක් ආසන්න වශයෙන් සිදු කරන ලදී.එක් එක් පික්සලය සඳහා ජීවිත කාලය දුර්වල කිරීම කලින් ගණනය කරන ලද τ අගයන් භාවිතයෙන් සවි කර ඇති අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ව්‍යාජ වර්ණ FLIM සුදුසු රූපයක් ලැබේ.එකම නාලිකාවේ සියලුම රූප හරහා වලිගයට ගැළපෙන ආයුකාල පරාසය සමාන වූ අතර, සෑම ක්ෂයවීමක්ම විශ්වාසදායක ගැළපීමක් සැපයීමට ප්‍රමාණවත් තරම් ෆෝටෝන නිපදවයි.FRET විශ්ලේෂණය සඳහා, ෆෝටෝන 11 ක පසුබිම් සංඥාවක් (FBG) සාමාන්‍යයෙන් ෆෝටෝන 100 ක අඩු තීව්‍රතා සීමාවක් යෙදීමෙන් පික්සල තෝරා ගන්නා ලදී.එක් එක් නාලිකාවේ ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය පර්යේෂණාත්මකව නිර්ණය කරන ලද නිවැරදි කිරීමේ සාධක මගින් නිවැරදි කරන ලදී: 69 වර්ණාවලි හරස්කඩ α 0.004, සෘජු උද්දීපනය β 0.0305, හඳුනාගැනීමේ කාර්යක්ෂමතාව γ 0.517.පික්සල් මට්ටමේ FRET කාර්යක්ෂමතාව පහත සමීකරණය භාවිතයෙන් ගණනය කෙරේ:
එහිදී FDD යනු දායක (කොළ) නාලිකාවේ නිරීක්ෂණය කරන ලද ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය, FDA යනු වක්‍ර උද්දීපනය යටතේ ප්‍රතිග්‍රාහක (රතු) නාලිකාවේ නිරීක්ෂණය කරන ලද ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය වන අතර FAA යනු සෘජු උද්දීපනය යටතේ ප්‍රතිග්‍රාහක (රතු) නාලිකාවේ නිරීක්ෂණය කරන ලද ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවයයි. PIE).නාලිකාවේ ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතා ස්පන්දන නිරීක්ෂණය කෙරේ).
LLPS ප්‍රතික්‍රියා විසඳුම් 100 µl අඩංගු 25 µM අඩංගු monomeric Tau441 (25 µM αS සමඟ හෝ රහිතව) LLPS බෆරයේ (ඉහත පරිපූරක) බන්ධන නොවන 96-ළිං ක්ෂුද්‍ර තහඩු මත ඇලවුම් තීරු ආලේපනය සහ ජල බිඳිති මගින් පරීක්ෂා කිරීමෙන් පසු WF සෑදීමෙන් පසු සමතුලිතතාවය.විනාඩි 10 ක් ඇතුළත.කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 48 කට පසුව, ප්රෝටීන් පරාල සහ පැල්ලම් ඇති බව තහවුරු විය.ඉන්පසු ළිංවලින් පරාලවලට උඩින් ඇති දියර ප්‍රවේශමෙන් ඉවත් කරන්න, ඉන්පසු විඝටන බෆරය ලීටර් 50 ක් (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) එකතු කර විනාඩි 10 ක් පුර්ව තනන්න.අධික ලවණ සාන්ද්‍රණය මගින් එල්එල්පීඑස් අවශේෂ PEG නිසා නැවත සිදු නොවන බව සහතික කරන අතර විද්‍යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්‍රියා මගින් පමණක් සෑදිය හැකි ප්‍රෝටීන් එකලස් කිරීම් විසුරුවා හරිනු ඇත.ඉන්පසු ළිඳේ පතුල මයික්‍රොපිපෙට් තුඩකින් පරිස්සමින් සීරීමට ලක් කර ඇති අතර එහි ප්‍රතිඵලය වූ විසඳුම හිස් නිරීක්ෂණ ළිඳකට මාරු කරන ලදී.පැය 1 ක් සඳහා 50 μM ThT සහිත සාම්පල පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමෙන් පසු, හුදකලා ලප තිබීම WF අන්වීක්ෂය මගින් පරීක්ෂා කරන ලදී.PBS හි 70-µM αS ද්‍රාවණයක 300 µl pH අගය 7.4, සෝඩියම් ඇසයිඩ් 0.01% 37 °C සහ 200 rpm සමඟ දින 7ක් සඳහා කක්ෂීය ෂේකර් මත පුර්වාගත කිරීමෙන් sonicated αS ෆයිබ්‍රිල් සකස් කරන්න.පසුව ද්‍රාවණය විනාඩි 30ක් සඳහා 9600×g ට කේන්ද්‍රාපසාරී කර, පෙති PBS pH 7.4 ට නැවත ලබා දී සොනිකේටඩ් (විනාඩි 1, 50% චක්‍රය, Vibra-Cell VC130 sonicator එකක 80% විස්තාරය, Sonics, Newton, USA) ෆයිබ්‍රිල් සාම්පල කුඩා තන්තු වල සාපේක්ෂ ඒකාකාර ප්රමාණයේ ව්යාප්තිය සමඟ.
FCS/FCCS විශ්ලේෂණය සහ ද්වි-වර්ණ අහඹු හඳුනාගැනීම (TCCD) PIE මාදිලිය භාවිතයෙන් FLIM-FRET අන්වීක්ෂ පරීක්ෂණ සඳහා භාවිතා කරන ලද MT200 කාල-විසඳන ලද fluorescent confocal අන්වීක්ෂය (Pico-Quant, Berlin, Germany) මත සිදු කරන ලදී.මෙම අත්හදා බැලීම් සඳහා ලේසර් බලය 6.0 µW (481 nm) සහ 6.2 µW (637 nm) වෙත එකතු කරන ලදී.ප්‍රශස්ත ගණන් කිරීමේ අනුපාත සාක්ෂාත් කර ගනිමින් සහ ඡායාරූප විරංජනය සහ සන්තෘප්තිය වළක්වා ගනිමින් භාවිතා කරන ෆ්ලෝරෝෆෝර යුගල සඳහා සමාන දීප්තියක් නිපදවීමට මෙම ලේසර් බලවල සංයෝජනය තෝරා ගන්නා ලදී.දත්ත එකතු කිරීම සහ විශ්ලේෂණය යන දෙකම වාණිජමය වශයෙන් පවතින SymfoTime64 අනුවාදය 2.3 මෘදුකාංගය (PicoQuant, Berlin, Germany) භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී.
LLPS භාවිතයෙන් ලබාගත් හුදකලා αS/Tau සමස්ථවල සාම්පල හුදකලා බෆරයකින් සුදුසු මොනොමොලියුලර් සාන්ද්‍රණයට තනුක කරනු ලැබේ (සාමාන්‍යයෙන් 1:500 තනුක කිරීම, සමස්ථයන් දැනටමත් coacervate සාම්පල වලින් හුදකලා විට අඩු සාන්ද්‍රණයක පවතින බැවින්).සාම්පල 1 mg/mL සාන්ද්‍රණයකින් BSA ද්‍රාවණයකින් පෙරා ඇති ආවරණ (Corning, USA) වෙත කෙලින්ම යොදන ලදී.
කොළ සහ රතු නාලිකා වල PIE-smFRET විශ්ලේෂණය සඳහා, මොනොමරික් සිදුවීම් නිසා ඇතිවන අඩු තීව්‍රතා සංඥා පෙරීමට ෆෝටෝන 25 ක අඩු තීව්‍රතා එළිපත්තක් යොදන ලදී (හුදකලා සමූහයන්ට සාපේක්ෂව මොනෝමර් සංඛ්‍යාව සමස්ථ සාම්පල ඉක්මවා යන බව සලකන්න).විශ්ලේෂණය සඳහා නිශ්චිතව එකතු කිරීම් තෝරා ගැනීම සඳහා පිරිසිදු මොනෝමර් සාම්පල විශ්ලේෂණයෙන් ලබාගත් මොනොමරික් αS හි සාමාන්‍ය තීව්‍රතාවය මෙන් පස් ගුණයක් ලෙස මෙම සීමාව ගණනය කරන ලදී.PIE ධාවක පරිපථය, TSCPC දත්ත ලබා ගැනීම සමඟ එක්ව, පසුබිම සහ වර්ණාවලි හරස්කඩ ඉවත් කිරීමට උපකාර වන ජීවිත කාලය සඳහා බර තැබීමේ පෙරහන යෙදීම සක්‍රීය කර ඇත.ඉහත සීමාවන් භාවිතයෙන් තෝරාගත් ගිනිදැල් තීව්‍රතාවය, ස්වාරක්ෂක-පමණක් සාම්පලවල තීව්‍රතාවය/බින් වලට එදිරිව සිදුවීමේ හිස්ටෝග්‍රෑම් වලින් නිර්ණය කරන ලද සාමාන්‍ය පසුබිම් සංඥා භාවිතයෙන් නිවැරදි කරන ලදී.විශාල සමස්ථයන් සමඟ සම්බන්ධිත පිපිරුම් සාමාන්‍යයෙන් කාල සටහනේ (1 ms ලෙස සකසා ඇත) අඛණ්ඩ බඳුන් කිහිපයක් අල්ලා ගනී.මෙම අවස්ථා වලදී, උපරිම ශක්තියේ බඳුනක් තෝරාගෙන ඇත.FRET සහ ස්ටෝචියෝමිතික විශ්ලේෂණය සඳහා, න්‍යායාත්මකව තීරණය කරන ලද ගැමා සාධකය γ (0.517) භාවිතා කරන ලදී.භාවිතා කරන උත්තේජක ලේසර් බලයේදී වර්ණාවලි හරස්කඩ සහ සෘජු උත්තේජක දායකත්වය නොසැලකිය හැකිය (පර්යේෂණාත්මකව තීරණය කරනු ලැබේ).පිපිරීමකදී FRET හි කාර්යක්ෂමතාව සහ ස්ටෝචියෝමිතිය පහත පරිදි ගණනය කෙරේ.