347 මල නොබැඳෙන වානේ දඟර නල රසායනික සංරචකය, හරස් සම්බන්ධිත ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (CLMS) භාවිතා කරමින් නව ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-ප්‍රතිචාර දක්වන මානව ලියුකෝසයිට් ප්‍රතිදේහජනක-A (HLA-A) චැපෙරෝන් ප්‍රෝටීන හඳුනා ගැනීම

Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ සීමිත CSS සහය ඇති බ්‍රවුසර අනුවාදයක් භාවිතා කරයි.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන කළ බ්‍රවුසරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා ප්‍රකාරය අක්‍රිය කරන්න).ඊට අමතරව, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාසිතා සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය පෙන්වමු.
එක් ස්ලයිඩයකට ලිපි තුනක් පෙන්වන ස්ලයිඩර්.ස්ලයිඩ හරහා ගමන් කිරීමට පසුපස සහ ඊළඟ බොත්තම් භාවිතා කරන්න, එක් එක් විනිවිදක හරහා ගමන් කිරීමට අවසානයේ ඇති ස්ලයිඩ පාලක බොත්තම් භාවිතා කරන්න.

නිෂ්පාදනය විස්තරය

මල නොබැඳෙන වානේ 347L දඟර නල, වානේ ශ්රේණිය: SS347L

ඉන්ටර්ෆෙරෝන් සංඥා පද්ධතිය පරිසරයෙන් ඇතිවන ව්‍යාධිජනක සහ ආවේණික ව්‍යාධි සංඥා පුළුල් පරාසයකට ප්‍රබල සයිටොකයින් ප්‍රතිචාරයක් ඇති කරයි, ඉන්ටර්ෆෙරෝන් ප්‍රේරණය කළ හැකි ප්‍රෝටීන වල උප කුලක ප්‍රේරණය කරයි.අපි ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-ප්‍රේරිත ප්‍රෝටීන වල වසම තුළ නව ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා හඳුනා ගැනීමට DSS-මැදිහත් වූ හරස්-සම්බන්ධක ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (CLMS) යෙදුවෙමු.අපේක්ෂිත ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-ප්‍රේරණය කළ හැකි ප්‍රෝටීන වලට අමතරව, අපි MX1, USP18, OAS3 සහ STAT1 වැනි කැනොනිකල් ඉන්ටර්ෆෙරෝන් ප්‍රේරණය කළ හැකි ප්‍රෝටීන වල නව අන්තර් අණුක සහ අන්තර් අණුක හරස් සම්බන්ධිත එකතු කිරීම් ද හඳුනා ගත්තෙමු.HLA-A ප්‍රෝටීන (H2BFS-HLA-A-HMGA1) මගින් සම-ප්‍රතිශක්තිකරණ භාවිතයෙන් සාදන ලද නව ඉන්ටර්ෆෙරෝන් ප්‍රේරණය කළ හැකි ප්‍රෝටීන ජාල සමූහයක විකලාංග වලංගුකරණය සහ අණුක ගතික ආකෘති නිර්මාණය භාවිතයෙන් ඔවුන්ගේ වැඩිදුර අධ්‍යයනය කෙරෙහි අපි අවධානය යොමු කළෙමු.ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණයේ අනුරූප ගතිකතාවයන් ආදර්ශනය කිරීම මගින් CLMS සොයාගැනීම් වල හඳුනාගත් අන්තර්ක්‍රියා පිලිබිඹු කරන අන්තර්ක්‍රියා ස්ථාන කිහිපයක් අනාවරණය විය.අපි එක්ව, ඉන්ටර්ෆෙරෝන් මගින් ප්‍රේරණය කරන ලද නව සංඥා සංකීර්ණ හඳුනා ගැනීම සඳහා CLMS පිළිබඳ නියමු අධ්‍යයනයක් ඉදිරිපත් කරන අතර, පිළිකා ක්ෂුද්‍ර පරිසරයේ ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා වල නව ගතිකත්වය හඳුනා ගැනීම සඳහා CLMS පුළුල් ලෙස භාවිතා කිරීමට බලාපොරොත්තු වෙමු.
අනුවර්තන ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාරයක් ආරම්භ වීමට පෙර, ධාරකයාගේ සහජ ආරක්ෂක පද්ධතිය ඉන්ටර්ෆෙරෝන් (IFNs) නම් ස්‍රාවය වන ඇල්ෆා-හෙල්ලික් සයිටොකයින් පවුලක් විසින් මැදිහත් වන ප්‍රති-ක්ෂුද්‍ර ජීවී ප්‍රතිචාරයක් සවි කරයි.I IFN පන්ති IFNα සහ IFNβ ප්‍රතිවෛරස්, ප්‍රොපොප්ටෝටික්, ප්‍රදාහ සහ ප්‍රතිප්‍රොලිෆරේටිව් තත්ව ඇතුළුව සෛලීය ප්‍රතිචාර සක්‍රීය කරයි.මිනිසුන් තුළ, IFNα හි උප වර්ග 13 ක් දන්නා අතර, සියල්ල වර්ණදේහ 91 මත පොකුරු වේ. පුදුමයට කරුණක් නම්, සායනික භාවිතය සඳහා අධ්‍යයනය කර ඇත්තේ IFNα2 පමණි.මෑතකදී, IFNα හි අනෙකුත් උප වර්ග පිළිබඳ පර්යේෂණ සඳහා විශේෂ අවධානය යොමු කර ඇත.මෑත අධ්යයනයකින් පෙන්නුම් කළේ කැනොනිකල් IFNα2 උප වර්ගයට සාපේක්ෂව HBV2 සහ HIV-13,4 අනුවර්තනය සීමා කිරීම සඳහා IFNα14 වඩාත් ඵලදායී සමස්ථානිකයක් බවයි.
සක්‍රීය I interferon receptor complexes (IFNAR1 සහ IFNAR2) Janus kinases TYK2 සහ JAK15,6 මගින් මැදිහත් වන සංඥා සම්ප්‍රේෂණ කඳුරැල්ලක් අවුලුවන බව තහවුරු වී ඇත.මෙම Janus kinases PH2 වසම-මැදිහත් වූ heterodimerization6 ආරම්භ කිරීම සඳහා tyrosine අවශේෂ මත phosphorylate signal transducers සහ transscriptional protein activators (STAT1 සහ STAT2).පසුව, IRF9 විසින් IFN-උත්තේජන සාධකය 3 ජානයේ (ISGF3) ට්‍රයිමරික් සංකීර්ණයක් සෑදීමට STAT heterodimers බන්ධනය කරයි, එය න්‍යෂ්ටිය වෙත පරිවර්ථනය වන අතර ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-උත්තේජන ජාන 2000 කට අධික ප්‍රමාණයක පිටපත් කිරීම ප්‍රේරණය කරයි (ISGs,8,6,5).
ISGs සහජ ප්‍රතිශක්තිකරණ පද්ධතියේ කොඳු නාරටිය සාදයි, විශේෂයෙන් වෛරස් ප්‍රහාරයට ප්‍රතිචාර වශයෙන්.වෛරස් ආසාදනයට එරෙහිව පළමු ආරක්‍ෂාව ලෙස, සෛල වේගයෙන් පුළුල් පරාසයක ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් සමඟ සෛලීය ප්‍රෝටීනවල පුළුල් අන්තර්ක්‍රියා යොදවයි.මෙම ප්‍රෝටීන වලට රටා හඳුනාගැනීමේ ප්‍රතිග්‍රාහක, සංඥා අණු, පිටපත් කිරීමේ සාධක සහ සෘජු ප්‍රතිවෛරස් ක්‍රියාකාරකම් සහිත ප්‍රෝටීන මෙන්ම ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාර වල සෘණ නියාමක ද ඇතුළත් වේ.ISG ක්‍රියාකාරකම් පිළිබඳ බොහෝ තොරතුරු පැමිණෙන්නේ අධි ප්‍රකාශන තිර 10,11 හෝ ජාන නිශ්ශබ්ද කිරීමේ ක්‍රම (siRNA, RNAi සහ CRISPR) 12,13 භාවිතා කරන ක්‍රියාකාරී තිර වලින් වන අතර එහි එක් එක් ISG ප්‍රකාශිත හෝ නිෂේධනය වන අතර ඒවායේ ක්‍රියාකාරකම් විවිධ වෛරස් මත පරීක්ෂා කෙරේ.මෙම අධ්‍යයනයන් මගින් එක් එක් ISG වල ප්‍රතිවෛරස් ගුණ නිර්ණය කර ඇතත්, එක් එක් ISG හි යටින් පවතින අණුක යාන්ත්‍රණයන් බොහෝ දුරට නොදනී.සම්පූර්ණ ක්‍රියාකාරිත්වය සහතික කිරීම සඳහා බොහෝ ප්‍රෝටීන සයිටොකයින් එකක් හෝ කිහිපයක් සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බව සාමාන්‍යයෙන් පිළිගැනේ, එබැවින් ISG සෘජුවම අන්තර්ක්‍රියා කරයි හෝ ඒවායේ අන්තර්ක්‍රියා සෛලීය ප්‍රෝටීන මගින් මැදිහත් වේ.උදාහරණයක් ලෙස, මෑත කාලීන photocrosslinked proteomics අධ්‍යයනයක් ATPase VCP/p97 ප්‍රධාන IFITM3 අන්තර්ක්‍රියා හවුල්කරුවෙකු ලෙස හඳුනාගෙන ඇති අතර, එහි නිෂේධනය වයිරස් අංශු 14 සමඟ IFITM3 හි ලයිසොසෝම වර්ගීකරණය, පිරිවැටුම සහ ප්‍රවාහනයෙහි දෝෂ ඇති කරයි.immunoprecipitation භාවිතා කරමින්, අපි කොලෙස්ටරෝල්-මැදිහත් වූ වෛරස් පරිණතභාවයට මැදිහත් වන IFITM1/2/3 සමඟ අන්තර්ක්‍රියා හවුල්කරුවෙකු ලෙස VAPA, වෙසිලිය ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන් හඳුනා ගත් අතර, යීස්ට් ද්වි-දෙමුහුන් පද්ධතියක් භාවිතා කරන තවත් අධ්‍යයනයකින් මෙය සනාථ විය.විද්යාත්මක සහාය 15, 16.
ආසාදන මර්දනය සහ මාරාන්තික පරිවර්තනය සම්බන්ධ මූලික ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාවලියක් වන්නේ ප්‍රතිදේහජනක ඉදිරිපත් කිරීම වන අතර එය ප්‍රධාන හිස්ටොකොම්පැටිබිලිටි සංකීර්ණ (MHC) අණු මගින් මැදිහත් වේ.පෙප්ටයිඩ (8-12 ඇමයිනෝ අම්ල දිග) කැඩී ගිය, නොමේරූ ලෙස අවසන් කරන ලද හෝ වැරදි ලෙස නැමුණු ප්‍රෝටීන වලින් MHC-I heterodimer වෙත පටවනු ලැබේ (MHC-I බර සහ සැහැල්ලු දාම වලින් සමන්විත, β-2-microglobulin; β2M) 17,18 .එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ස්ථායී MHC-I ට්‍රයිමර් සෛල මතුපිටට ප්‍රවාහනය කරනු ලැබේ, එහිදී ඒවා අන්තර් සෛලීය පෙප්ටයිඩ CD8+ T සෛල වෙත (සයිටොටොක්සික් T සෛල) ඉදිරිපත් කරයි.T සෛල මෙම ව්යාධිජනක සහ පිළිකා විශේෂිත ප්රතිදේහජනකයක් රැගෙන යන සෛල හඳුනාගෙන විනාශ කරයි.එහි ප්‍රතිඵලයක් වශයෙන්, රෝග කාරක සහ පිළිකා සෛල බොහෝ විට ප්‍රතිශක්තිකරණ නිරීක්ෂණ වළක්වා ගැනීම සඳහා ප්‍රතිදේහජනක ඉදිරිපත් කිරීමේ ක්‍රියාවලිය යටපත් කරයි.මීට අමතරව, MHC-I මිනිස් පිළිකාවලින් 40-90% තුළ අඩු වී ඇති අතර බොහෝ විට දුර්වල පුරෝකථනයක් සමඟ සම්බන්ධ වේ.
ව්යාධිජනක වලට ප්රතිචාර දැක්වීමට සම්බන්ධ ජාන ඉක්මනින් විවේකයක් සහ ක්රියාකාරී පිටපත් කිරීමේ තත්වයක් අතර මාරු විය යුතුය.එබැවින්, ප්‍රවර්ධක ක්‍රොමැටින් 20,21 ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම සහ වෙනස් කිරීම ඇතුළුව, කෙටි කාලයකදී ඉහළ IFN ඉල්ලුමට ප්‍රතිචාර දැක්වීම සඳහා සෛලීය ප්‍රෝටීන කිහිපයක් සම්බන්ධ වී ඇතැයි උපකල්පනය කෙරේ.බොහෝ අධ්‍යයනයන් IFN ඉදිරියේ තනි ISG ප්‍රෝටීන් හවුල්කරුවන් හඳුනා ගැනීම කෙරෙහි අවධානය යොමු කර ඇත.ආදර්ශ සෛල පද්ධතිවල ප්‍රෝටෝමික් සහ ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටොමික් අධ්‍යයනයන් කිහිපයක් සෛලීය භූ දර්ශනය මත IFN හි බලපෑම පැහැදිලි කර ඇත.කෙසේ වෙතත්, ඉන්ටර්ෆෙරෝන් විසින් ප්‍රේරණය කරන ලද ගතිකත්වය පිළිබඳ වැඩෙන අවබෝධයක් තිබියදීත්, ISG වල සම්බන්ධය ගැන අප තවමත් දන්නේ අල්ප වශයෙනි.ඉන්ටර්ෆෙරෝන් සංඥාකරණයේ සංකීර්ණත්වය සහ කාලය මත රඳා පවතින ගතිකත්වය සලකා බලන විට, ප්‍රශ්න දෙකක් පැන නගී: (i) වේගවත් සංඥාකරණයට සම්බන්ධ බහු ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ ස්ථායී කිරීමට සහ උගුලට හසුකර ගැනීමට හැකි ද, (ii) මෙම අන්තර්ක්‍රියා ත්‍රිමාණ අවකාශයට සිතියම්ගත කළ හැකිද?
මෙම ගැටළු විසඳීම සඳහා, අපි IFNα-ප්‍රේරිත ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා ජාලය සහ එහි ගතිකත්වය අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (CLMS) සමඟින් disuccinimide suberate-mediated රසායනික හරස් සම්බන්ධ කිරීම (DSS) ක්‍රියාත්මක කළෙමු.ඩීඑස්එස් vivo හි ප්‍රෝටීන සහ/හෝ ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණවල සමීප අපද්‍රව්‍ය අතර සහසංයුජ බන්ධන එක් කරයි.පසුකාලීන MS විශ්ලේෂණය මගින් අභ්‍යන්තර සම්බන්ධතා ලෙස හැඳින්වෙන විශේෂිත ප්‍රෝටීනයක් තුළ කලාපවල අවකාශීය සමීපත්වය පිළිබිඹු කරන විශේෂිත හරස් සම්බන්ධක අඩවි හෙළි කරයි, නැතහොත් අන්තර් සම්බන්ධතා ලෙස හැඳින්වෙන ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණවල උප ඒකක.මෙම ප්‍රවේශය භාවිතා කරමින්, අපි නව ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ මෙන්ම ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-ප්‍රේරිත බහු ප්‍රෝටීන අන්තර්ක්‍රියා ජාල කිහිපයක් හඳුනාගෙන ඇත්තෙමු.මෙම නව අන්තර්ක්‍රියා වල උප කුලකයක් තවදුරටත් පරීක්ෂා කිරීමෙන්, අපි H2BFS (H2B histone-type FS; මෙතැන් සිට H2B ලෙස හැඳින්වේ) සහ MDN1 HLA-A සඳහා බන්ධන හවුල්කරුවන් ලෙස ක්‍රියා කරන බව පෙන්නුම් කරමු.
Flo-1 සෛල යනු esophageal adenocarcinoma හි වඩාත් ප්‍රචලිත වීට්‍රෝ ආකෘතිවලින් එකකි, මන්ද ඒවා esophageal tumors22,23 හි ප්‍රධාන ලක්ෂණ අනුකරණය කරයි.කෙසේ වෙතත්, සියලුම පිළිකා ප්‍රතිශක්තිකාරක නොවන අතර, Flo-1 සෛල ඉන්ටර්ෆෙරෝන් ප්‍රතිකාරයට ප්‍රතිචාර දක්වයිද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා, අපි Flo-1 සෛල 10 ng/ml IFNα සමඟ පැය 72 ක් ප්‍රතිකාර කළෙමු.Flo-1 සෛල pSTAT1 සහ IRF1 හි මුල් ප්‍රේරණය පෙන්නුම් කළ අතර, ප්‍රතිකාරයෙන් පැය 2 කට පසු ආරම්භ වී පැය 72 ක් අඛණ්ඩව, IRF1 හි ස්ථාවර මට්ටම්වල කාලය මත රඳා පවතින අඩුවීමක් (Figure 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, සහ ISG15) IFNα වෙත සම්භාව්‍ය මධ්‍ය සහ ප්‍රමාද අවධි ප්‍රතිචාර අනුකරණය කරමින් පැය 6කට පසුව දැඩි ලෙස ප්‍රේරණය වී ඇති බව සොයා ගන්නා ලදී (රූපය 1A).මෙම දත්ත එක්ව, ඉන්ටර්ෆෙරෝන් ප්‍රතිචාර අධ්‍යයනය කිරීමට මෙම සෛලීය ආකෘතිය භාවිතා කළ හැකි බව යෝජනා කරයි.
IFNα ප්‍රතිකාරයෙන් පසු Flo-1 සෛලවල අවකල ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශන ප්‍රතිචාර.(A) 2, 6, 24, 48 සහ 72 පැය සඳහා 10 ng/ml IFNα සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද Flo-1 සෛලවල ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශනය, දක්වන ලද ISG ප්‍රතිදේහ භාවිතයෙන් immunoblot විසින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.(B) සඳහන් කරන ලද වේලාවන් සහ සාන්ද්‍රණයන් සඳහා DSS සමඟ හරස් සම්බන්ධ කිරීමෙන් පසු සම්පූර්ණ සෛල නිස්සාරණයේ Coomassie නිල් පැහැති SDS-PAGE ජෙල්.(C) ප්‍රෝටීන හරස් සම්බන්ධ කිරීමේ මට්ටම තක්සේරු කිරීම සඳහා එම සාම්පල වලින් p53(DO-1) ප්‍රතිදේහ සමඟ නියෝජිත ප්‍රතිශක්තිය පරීක්ෂා කරන ලදී.
ස්ථානීය ප්‍රෝටීන අන්තර්ක්‍රියා භූ දර්ශනය ග්‍රහණය කර ගැනීම සඳහා, අපි එහි ඉහළ පටල පාරගම්යතාව සහ සාපේක්ෂව කෙටි ප්‍රතික්‍රියා කාලය හේතුවෙන් බහුලව භාවිතා වන හරස් සම්බන්ධක කාරකයක් වන DSS භාවිතා කළෙමු.කෙටි ප්‍රතික්‍රියා කාලය හරස් සම්බන්ධිත ප්‍රෝටීන වල විශාල සමූහ සෑදීම වැළැක්වීමට උපකාරී වන අතර එමඟින් හරස් සම්බන්ධකයේ ස්ථායීතාවය පවත්වා ගනී.ප්‍රශස්ත DSS සාන්ද්‍රණය තීරණය කිරීමට සහ අධික ලෙස සම්බන්ධ වීම වළක්වා ගැනීමට, අපි පළමුව සෛල 5, 2.5, සහ 1 mM DSS වෙත පිළිවෙලින් මිනිත්තු 5, 10, 5 සහ 30 සඳහා නිරාවරණය කර Coomassie-stained SDS-PAGE මගින් ලයිසේට් විශ්ලේෂණය කළෙමු. (දත්ත පෙන්වා නැත) .සෛල ලයිසේට් අඩුම සාන්ද්‍රණයේදී සහ කෙටිම කාල සීමාවේදී ඉතා හරස් සම්බන්ධ වී ඇති බව පෙනේ.එබැවින්, DSS මිනිත්තු 5 කින් 1, 0.5 සහ 0.1 mM ලෙස නම් කරන ලදී (රූපය 1B).මිනිත්තු 5 ක් සඳහා 0.5 mM DSS සමඟ ප්‍රශස්ත හරස් සම්බන්ධතා නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර, IFNα සමඟ ප්‍රතිකාර කරන සෛල සඳහා මෙම කොන්දේසි තෝරා ගන්නා ලදී.ඊට අමතරව, ප්‍රෝටීන් හරස් සම්බන්ධක මට්ටම තක්සේරු කිරීම සඳහා p53 (DO-1) ප්‍රතිදේහය භාවිතයෙන් සිදු කරන ලද බටහිර බ්ලට් එකක් රූප සටහන 1C පෙන්වයි.
Flo-1 සෛල හරස් සම්බන්ධකය එකතු කිරීමට පෙර පැය 24 ක් සඳහා 10 ng/ml IFNα සමඟ ප්රතිකාර කරන ලදී.හරස් සම්බන්ධිත සෛල පසුව ද්වි-පියවර ප්‍රෝටෝලිසිස් මගින් ලයිස් කරන ලද අතර ප්‍රෝටීන FASP මගින් සකසන ලදී (රූපය 2)24,25.හරස් සම්බන්ධිත ට්‍රිප්ටික් පෙප්ටයිඩ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී (රූපය 2).MS/MS වර්ණාවලි පසුව ප්‍රෝටීන් අනුපිළිවෙලට ගැලපෙන අතර MaxQuant26,27 සමඟ ප්‍රමාණ කෙරේ.SIM-XL වැඩසටහන භාවිතයෙන් ලබාගත් වර්ණාවලියෙන් හරස්-සම්බන්ධිත පෙප්ටයිඩ හඳුනාගෙන ඇති අතර, xQuest28 සහ SIM-XL29 විවෘත කේත පරිගණක මෘදුකාංග නල මාර්ග භාවිතා කරමින් තනි සංයෝග සංකීර්ණ ජාලයකට ඒකාබද්ධ කරන ලදී (රූපය 2).SIM-XL සරල හෝ සංකීර්ණ ප්‍රෝටීන මිශ්‍රණවල ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන අන්තර්ක්‍රියා, අභ්‍යන්තර දාම සහ තනි දාම හඳුනා ගන්නා අතර ප්‍රෝටීන් ව්‍යුහවල අන්තර්ක්‍රියා දෘශ්‍යමාන කිරීම සඳහා ස්ක්‍රිප්ට් සපයයි.ඊට අමතරව, එය MS/MS29 වර්ණාවලියේ ගුණාත්මක භාවයට අනුව ID ලකුණු ලෙස එක් එක් හරස් යොමු කිරීම් ශ්‍රේණිගත කරයි.ඉතා විශ්වාසදායක ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා සහ සංකීර්ණ කිහිපයක් හඳුනාගෙන ඇති අතර, අණුක ගතික (MD) ආකෘති නිර්මාණය (පය. 2) 30, 31 භාවිතා කරමින් සංකීර්ණවල සම-ප්‍රතිශක්තිකරණ සහ අනුරූප වෙනස්වීම් භාවිතයෙන් නව අන්තර්ක්‍රියා මාලාවක් තවදුරටත් විමර්ශනය කර ඇත.
CLMS ක්‍රමයේ ක්‍රමානුකූල දළ විශ්ලේෂණය.Flo-1 සෛල පැය 24ක් සඳහා 10 ng/ml IFNα සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද අතර පසුව DSS භාවිතා කරමින් සිටු ප්‍රෝටීන හරස් සම්බන්ධ කිරීමකින් පසුව සෛල ලයිසිස් සහ ට්‍රයිප්සිනීකරණය සිදු කරන ලදී.හරස්-සම්බන්ධිත සාම්පල Orbitrap ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයක් භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලද අතර LC-MS/MS අතරතුර පෙප්ටයිඩ පූර්වගාමීන් ඛණ්ඩනය කිරීම සඳහා තවදුරටත් සාම්පල ලබා ගන්නා ලදී.Crosslinked Peptides (SIM-XL) වැඩසටහනේ Spectrum Recognition Machine භාවිතයෙන් ලබාගත් වර්ණාවලියෙන් සම්බන්ධිත පෙප්ටයිඩ දෙකක් හඳුනාගෙන ඇති අතර, සියලුම සංයෝග පරිගණකමය නල මාර්ග භාවිතයෙන් සංකීර්ණ ජාලයකට ඒකාබද්ධ කරන ලදී.ව්‍යාජ ධනාත්මක අනුපාත (FDR) ලකුණු මත පදනම්ව අඩු විශ්වාසනීය අන්තර්ක්‍රියා පෙරහන් කරන්න.නව අධි-විශ්වාසනීය ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා කිහිපයක් සම-ප්‍රතිශක්තිකරණ භාවිතයෙන් තවදුරටත් තහවුරු කරන ලද අතර, අණුක ගතික (MD) ආකෘතිකරණය භාවිතයෙන් සංකීර්ණවල අනුකූල වෙනස්කම් පරීක්ෂා කරන ලදී.
පිළිවෙළින් ~30,500 සහ ~28,500 පෙප්ටයිඩ මැක්ස්කුවාන්ට් භාවිතයෙන් අනාවරණ වූ සහ උත්තේජනය කරන ලද IFNα සාම්පල හඳුනා ගන්නා ලදී (පරිපූරක වගුව S1, Fig. 3A).අවස්ථා දෙකෙහිම පෙප්ටයිඩ දිග ව්‍යාප්තිය විශාල පෙප්ටයිඩවල වැඩි ප්‍රතිශතයක් පෙන්නුම් කරයි, එය හරස් සම්බන්ධිත පෙප්ටයිඩ පවතින බව පෙන්නුම් කරයි (රූපය 3B,C).මීට අමතරව, IFNα-ප්‍රතිකාර කළ සාම්පලවල 40-55 පරාසයේ විශාල පෙප්ටයිඩ විශාල ප්‍රමාණයක් පැවතුනි (රූපය 3C).MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, සහ HLA-F (Figure 3D) ඇතුළුව ප්‍රතිකාර නොකළ සාම්පල හා සසඳන විට log2 තීව්‍රතාවයට එරෙහිව ප්‍රෝටීන් සිතියම්ගත කිරීම සම්භාව්‍ය ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-උත්තේජනය කරන ලද ප්‍රෝටීන් බහුලව පවතින බව පෙන්නුම් කළේය.ප්‍රතික්‍රියා මාර්ග දත්ත සමුදාය භාවිතා කරමින් IFNα ප්‍රතිකාරයට ප්‍රතිචාර වශයෙන් තුන් ගුණයකට වඩා පොහොසත් ප්‍රෝටීන සඳහා මාර්ග විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ MHC-I-මැදිහත් වූ ප්‍රතිදේහජනක ඉදිරිපත් කිරීම සහ සැකසීම වඩාත් ප්‍රමුඛ මාර්ගය බව (Figure 3E).පෙර වාර්තාවලට අනුකූලව, OAS සහ ISG15 මගින් මැදිහත් වූ ප්‍රතිවෛරස් ප්‍රතිචාර මෙන්ම IFNα/β සහ සයිටොකයින් සංඥා කිරීමද සක්‍රිය කළ මාර්ග අතර විය.මීට අමතරව, SIM-XL භාවිතා කරමින් මුලින් අත්පත් කරගත් MS/MS වර්ණාවලියෙන් ලයිසීන් සහ සෙරීන් විශේෂිත ප්‍රෝටීන හරස් සබැඳි හඳුනා ගන්නා ලදී.මෑත අධ්‍යයනයකින් ISG 104ක් වෛරස් පන්ති 9කින් වෛරස් 20ක් පුරා පැතිරී ඇති බව වාර්තා කළේ සෛල වර්ග 5ක් තුළ තනි පුද්ගල ISG අධි ප්‍රකාශන අධ්‍යයනයන්හි මෙටා විශ්ලේෂණයෙනි.කෙසේ වෙතත්, විශාල දත්ත කට්ටල පිරික්සීමේ ගණනය කිරීමේ සීමාවන් මඟහරවා ගැනීම සඳහා, අපි Padaria et al විසින් වාර්තා කරන ලද IRDS ජාන ලැයිස්තුව අතර ඇති විය හැකි අන්තර්ක්‍රියා ගවේෂණය කිරීමට කුඩා දත්ත කට්ටලයක් සමඟ ආරම්භ කළෙමු, ඒවායින් බොහොමයක් ISG වේ.
IFNα (MaxQuant වෙතින් ලබාගත් දත්ත) වලට ප්‍රතිචාර වශයෙන් වෙනස් ලෙස ප්‍රකාශිත හරස් සම්බන්ධිත ප්‍රෝටීන හඳුනා ගැනීම.(A) IFNα14 ප්‍රතිකාර කළ සහ ප්‍රතිකාර නොකළ Flo-1 සාම්පලවල හඳුනාගෙන ඇති පොදු සහ සුවිශේෂී පෙප්ටයිඩ සංඛ්‍යාව නියෝජනය කරන Venn රූප සටහන.ප්‍රතිකාර නොකළ (B) සහ IFNα ප්‍රතිකාර කළ (C) ​​හරස් සම්බන්ධිත සාම්පලවල පෙප්ටයිඩ දිග බෙදා හැරීම.(D) ප්‍රතිකාර නොකළ සහ IFNα14 ප්‍රතිකාර කළ Flo-1 සෛල අතර log2 (LFQ තීව්‍රතාවය) නියෝජනය කරන තාප සිතියම.වම් පුවරුව IFNα ඉදිරියේ වඩාත් සක්‍රීයව සක්‍රිය වූ ප්‍රෝටීන පෙන්වයි.(E) IFNα ප්‍රතිකාරයෙන් පසු ප්‍රධාන සාරවත් මාර්ග 20 නියෝජනය කරන හිස්ටෝග්‍රෑම්.ප්‍රතික්‍රියා මාර්ග දත්ත සමුදාය මගින් නියාමනය කරන ලද IFNα-ප්‍රතිචාර දක්වන ප්‍රෝටීන වල හතර ගුණයකට වඩා වැඩි වෙනස්කම් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-මැදිහත් වූ ISG උත්තේජනය හොඳින් ලේඛනගත කර ඇත, නමුත් අණුක මට්ටමේදී මෙම ප්‍රෝටීන පුළුල් පරාසයක ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් වලින් අවසන් වන ආකාරය දුර්වල ලෙස වටහාගෙන ඇත.අපි දන්නා ISG අතර ඉහළ විශ්වාසයක් ඇති ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා විමර්ශනය කළෙමු.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, අපි IFNα ප්‍රතිකාරයට ප්‍රතිචාර වශයෙන් විශාල සංකීර්ණයක් සාදන MX1, USP18, ROBO1, OAS3 සහ STAT1 ප්‍රෝටීන ඇතුළු ජාලයක් හඳුනා ගත්තෙමු (රූපය 4, වගුව S2) 32,33,34.වැදගත්ම දෙය නම්, මෙම අන්තර්ක්‍රියා IFNα සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද සියලුම ත්‍රිත්ව වල දක්නට ලැබෙන අතර ප්‍රතිකාර නොකළ සාම්පලවල සොයා නොගත් අතර, ඒවා IFNα ප්‍රතිකාරයට ප්‍රතිචාර වශයෙන් විශේෂයෙන් පිහිටුවා ඇති බව යෝජනා කරයි.STAT1 මෙම ISG වල ප්‍රකාශනය පිටපත් කිරීමේ නියාමනය කරන බව දන්නා නමුත් ප්‍රෝටීන් මට්ටමින් ISG සමඟ එහි අන්තර්ක්‍රියා අධ්‍යයනය කර නොමැත.STAT1 හි ස්ඵටික ව්‍යුහය පෙන්නුම් කළේ එහි හෙලික්සීය වසම (CCD) ඩිමර්ස් සෑදීමේදී DNA හෝ ප්‍රෝටෝමර් සමඟ අන්තර්ක්‍රියාවලට සම්බන්ධ නොවන බවයි.මෙම α-හෙලික්ස් අන්තර්ක්‍රියා සිදු වීම සඳහා ප්‍රධාන වශයෙන් ජලාකර්ෂණීය පෘෂ්ඨ ප්‍රදේශයක් සපයන හෙලික්සීය හීලික්ස් ව්‍යුහයක් සාදයි 35 .අපගේ CLMS දත්ත තුළ, STAT1 සමඟ බොහෝ අන්තර්ක්‍රියා සිදුවී ඇත්තේ CCD, සම්බන්ධක වසම හෝ C-පර්යන්ත වලිගය (අවශේෂ 700-708) (රූපය 4A) ට පෙර ඇති SH2 වසම තුළ බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු.පෙර අධ්‍යයනයකින් වාර්තා වූයේ USP18 STAT2 හි CCD සහ DNA-බන්ධන වසම (DBD) වෙත බන්ධනය වන අතර I වර්ගයේ ඉන්ටර්ෆෙරෝන් සංඥා 24 නිෂේධනය කිරීම සඳහා I ඉන්ටර්ෆෙරෝන් ප්‍රතිග්‍රාහක IFNAR2 හි අනු ඒකකයට බඳවා ගන්නා බවයි.USP18 උත්ප්‍රේරක වසම STAT1 DBD (Figure 4A,D) සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බව ද අපගේ දත්ත පෙන්වා දී ඇත, STAT1 සහ STAT2 යන දෙකම IFNAR2 වෙත USP18 ආකර්ෂණය කර ගැනීමේ කාර්යභාරයක් ඉටු කළ හැකි බව යෝජනා කරයි.
ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් ISG ජාලය IFNα සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද හරස් සම්බන්ධිත සෛල තුළ හඳුනාගෙන ඇත.(A) අන්තර් අණුක අන්තර්ක්‍රියා නියෝජනය කරන රේඛා සහිත ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා (SIM-XL වැඩසටහනේ ජනනය කරන ලද) පෙන්වන 2D අන්තර්ක්‍රියා කුමන්ත්‍රණය (හරස් සබැඳි කඩඉම් 3.5 ලෙස සකසා ඇත).විවිධ අනන්‍යතා වල වසම් ඒවායේ වර්ණයෙන් සලකුණු කර ඇත32: MX1 වසම, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), සහ GED (569–660).OAS3 වසම්: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), සහ OAS1_C (903-108).වසම ROBO1, Ig_3 (67-151), I-set (170-258), I-set (262-347), Ig_3 (350-432), Ig_3 (454-529), fn3 (562-646), fn3 (678-758) සහ fn3 (777-864).STAT1 ක්ෂේත්‍ර: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), සහ STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) පිළිවෙලින් නිල් සහ රතු ලෙස ලේබල් කර ඇති අන්තර්ක්‍රියා සහ අන්තර්ක්‍රියා සහිත හරස් සම්බන්ධිත ප්‍රෝටීන වල (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, සහ STAT1) චක්‍රලේඛ නරඹන්නා.හරස්-සම්බන්ධක එළිපත්ත 3.5 ලෙස සකසා ඇත.තිත් බිම් කොටස් MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) සහ OAS3 (F) සමඟ STAT1 අන්තර්ක්‍රියා අඩවි මෙන්ම පෙප්ටයිඩ දෙක අතර K හෝ S අන්තර්ක්‍රියා අඩවි ද දක්වයි.රූපයේ, හරස් සබැඳි ලකුණු සීමාව 3.0 ලෙස සකසා ඇත.(G) STAT1 සහ OAS3 DI වසම් අතර විවිධ අන්තර්ක්‍රියා අඩවි PyMol හි ප්‍රෝටීන් ව්‍යුහයන් මත අධිස්ථාපනය කර ඇත (PyMOL අණුක ග්‍රැෆික් පද්ධතිය, අනුවාදය 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) සහ OAS3 (pdb id: 4s3n34).) වැඩසටහන.
USP18 හි සමස්ථානික දෙකක් මිනිසුන් තුළ විස්තර කර ඇත, ප්‍රධාන වශයෙන් න්‍යෂ්ටියේ පිහිටා ඇති පූර්ණ-දිග ප්‍රෝටීනයක් සහ N-පර්යන්ත වසමක් නොමැති සමස්ථානිකයක්, USP18-sf, සයිටොප්ලාස්ම් සහ න්‍යෂ්ටිය 36 තුළ ඒකාකාරව බෙදා හරිනු ලැබේ.මීට අමතරව, N-terminus ව්‍යුහගත නොවන බවට පුරෝකථනය කරන ලද අතර එයට isopeptidase ක්‍රියාකාරකම් හෝ ISG1537 බන්ධනය අවශ්‍ය නොවේ.අපගේ අධ්‍යයනයේ දී හඳුනාගත් බොහෝ අන්තර්ක්‍රියා ප්‍රෝටීනයේ N-පර්යන්තයේ පිහිටා ඇති අතර, මෙම අන්තර්ක්‍රියාවලට පූර්ණ-දිග USP18 (රූපය 4A,D) ඇතුළත් වන අතර එමඟින් න්‍යෂ්ටිය තුළ සිදු විය හැකි බව යෝජනා කරයි.එපමනක් නොව, අපගේ දත්ත මගින් පෙන්නුම් කරන්නේ N-terminus ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා සඳහා විශේෂිත වූ බවයි.IFNAR2 බන්ධන අඩවිය ශේෂයන් 312-368 අතර පිහිටා ඇති අතර, විශේෂයෙන්, සංකීර්ණයේ ඇති ප්‍රෝටීන කිසිවක් මෙම කලාපයට බන්ධනය නොවේ (රූපය 4A) 37,38 .මෙම දත්ත එකට ගත් විට පෙන්නුම් කරන්නේ IFNAR2 බන්ධන වසම ප්‍රතිග්‍රාහක ප්‍රෝටීන් විසින් පමණක් භාවිතා කරන බවයි.මීට අමතරව, OAS3 සහ ROBO1 පමණක් N-terminus සහ IFNAR2 බන්ධන අඩවියේ ඉහළට වසම් සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති බව සොයා ගන්නා ලදී (රූපය 4A).
ROBO1 ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් සංඥා අණු වල immunoglobulin (Ig) සුපිරි පවුලට අයත් වන අතර බාහිර සෛලීය කලාපයේ Ig වසම් පහකින් සහ ෆයිබ්‍රොනෙක්ටින් (Fn) වසම් තුනකින් සමන්විත වේ.මෙම බාහිර සෛලීය වසම් වලට පසුව පටල-ආසන්න කලාපයක් සහ තනි ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් හෙලික්ස් 39. ව්‍යුහගත නොවූ අන්තර් සෛලීය කලාපයක් C-පර්යන්තයේ පිහිටා ඇති අතර ඵලදායි ප්‍රෝටීන් බන්ධනයට මැදිහත් වන සංරක්‍ෂිත අනුක්‍රමික මෝස්තර අඩංගු වේ39.ඇමයිනෝ අම්ල ~1100 සිට 1600 දක්වා විහිදෙන කලාපය බොහෝ දුරට අක්‍රමවත් වේ.MX1 ROBO1 සමඟ Ig, Fn සහ අන්තර් සෛලීය වසම් හරහා අන්තර්ක්‍රියා කරන බව අපට පෙනී ගිය අතර, STAT1 සමඟ බොහෝ අන්තර්ක්‍රියා එහි CCD, සම්බන්ධක වසම සහ ROBO1 හි C-පර්යන්තය අතර සිදු වේ (රූපය 4A,E).අනෙක් අතට, DI, DIII සහ OAS3 සම්බන්ධක කලාප සමඟ අන්තර්ක්‍රියා ROBO1 ප්‍රෝටීනය පුරා බෙදා හරින ලදි (රූපය 4A).
oligoadenylate synthase (OAS) ප්‍රෝටීන් පවුල අන්තර් සෛලීය ද්විත්ව තන්තු සහිත RNA (dsRNA) පිළිගෙන බන්ධනය කරයි, අනුකූල වෙනස්කම් වලට භාජනය වේ, සහ 2′,5′-සම්බන්ධිත oligoadenylates (2-5 As) 40 සංස්ලේෂණය කරයි.OAS තුන අතර, OAS3 dsRNA සඳහා ඉහළම බැඳීමක් පෙන්නුම් කරන අතර RNase L සක්‍රිය කළ හැකි 2-5 As හි අවම ප්‍රමාණය සංස්ලේෂණය කරන අතර එමඟින් වෛරස් අනුවර්තනය 41 සීමා කළ හැකි බව සොයා ගන්නා ලදී.OAS පවුල සමන්විත වන්නේ පොලිමරේස් බීටා (pol-β) වැනි නියුක්ලියෝටයිඩ ට්‍රාන්ස්පේස් වසම් වලින්.C-terminal domain (DIII) හි උත්ප්‍රේරක ක්‍රියාකාරකම් OAS342 සක්‍රිය කිරීම සඳහා අවශ්‍ය වන dsRNA-බන්ධන වසම (DI) මත රඳා පවතින බව පෙර පර්යේෂණ මගින් පෙන්වා දී ඇත.OAS3 හි DI සහ DII වසම් CCD සහ SH2 සහ STAT1 TAD අතර කුඩා සන්ධි කලාපයක් සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 4A,F).ප්‍රෝටීන් ව්‍යුහය මත විවිධ හරස් සම්බන්ධක අඩවි ආවරණය කිරීමෙන් β-ෂීට් සහ DBD STAT1 ලූපය සහ OAS3 හි DI වසමෙහි 60-75 අවශේෂ මගින් සාදන ලද විවෘත සාක්කුවක් හෝ කුහරයක් අතර අන්තර්ක්‍රියාවක් අනාවරණය විය (රූපය 4G).සංකීර්ණයේ ඇති ප්‍රෝටීන වල දිශානතිය ද OAS3 සමඟ ඇති අන්තර්ක්‍රියා කිසිවක් එහි DI වසමේ DNA බන්ධන හැකියාවට බාධා නොකළ බව පෙන්නුම් කළේය (Fig. S1A).මීට අමතරව, GTPase MX1 හි N-පර්යන්ත වසම OAS3 හි DI සහ DIII වසම් සමඟ පුළුල් ලෙස අන්තර්ක්‍රියා කරයි (රූපය 4A).IFNα-ප්‍රතිකාර කළ පුනරාවර්තන තුනෙහිම OAS1 සහ MX1 අතර අන්තර්ක්‍රියාවක් ද අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු, එහිදී තනි OAS1 වසමක් (උත්ප්‍රේරක ක්‍රියාකාරී) MX1 වසම් තුනම සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරයි (රූපය S2A,B).
MX ප්‍රෝටීන යනු GTP බන්ධනය කර ජල විච්ඡේදනය කරන N-පර්යන්ත GTPase වසමක්, ස්වයං-එකලස් කිරීමට මැදිහත් වන අතරමැදි වසමක් සහ GTPase (LZ) ලෙස ක්‍රියා කරන C-පර්යන්ත ලියුසීන් සිපර් අඩංගු ඩයිනීන් වැනි GTPases විශාල පවුලක කොටසකි. )domain effector domain25,43.MX1 වෛරස් ජානයේ පිටපත් කිරීම අවහිර කිරීම සඳහා වයිරස් පොලිමරේස්වල උප ඒකකවලට බන්ධනය කරයි43.කලින් වාර්තා කරන ලද යීස්ට් ද්වි-දෙමුහුන් තිරයක් පෙන්නුම් කළේ PIAS1-ආශ්‍රිත MX1 DNA-බන්ධන ක්‍රියාකාරකම් අවහිර කිරීමෙන් STAT1-මැදිහත් වූ ජාන සක්‍රීය කිරීම වළක්වන අතර SUMO E344,45 ligase ක්‍රියාකාරකම් ඇති බවයි.මෙහිදී, අපි MX1 STAT1 (Figure 4C,D) වෙත බන්ධනය වන බව පෙන්නුම් කරමු, කෙසේ වෙතත් මෙම අන්තර්ක්‍රියාව IFNα ට ප්‍රතිචාර වශයෙන් STAT1-මැදිහත් වූ ජාන සක්‍රිය කිරීමට බලපාන ආකාරය වැඩිදුර අධ්‍යයනය අවශ්‍ය වේ.මීට අමතරව, IFNα-ප්‍රතිකාර කළ පුනරාවර්තන තුනෙහිම (Fig. S2C) MX1 IFIT3 සහ DDX60 සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බව ද අපට පෙනී ගියේය.
DDX60 යනු IFN-ප්‍රේරිත සයිටොප්ලාස්මික් හෙලිකේසයක් වන අතර එය වෛරස් RNA46 හි RIG-I-ස්වාධීන පිරිහීමෙහි කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බව කලින් වාර්තා කර ඇත.එය RIG-I සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන අතර ලිගන්ඩ්-විශේෂිත ආකාරයෙන් එහි සංඥා ක්‍රියාත්මක කරයි 46. DDX60 DEXD/H-Box හෙලිකේස් වසමකින් සහ වෛරස් RNA සහ DNA47 බන්ධනය කරන C-terminal helicase domain එකකින් සමන්විත වේ.MX1 සහ IFIT3 සමඟ එහි අන්තර්ක්‍රියා බොහොමයක් සිදු වන්නේ කැනොනිකල් වසම් හෝ මෝස්තර නොමැතිව දිගු N- සහ C-පර්යන්ත කලාප තුළය (Fig. S2E,F).කෙසේ වෙතත්, MX1 DEXD/H-Box හෙලිකේස් වසම සමඟ ද සම්බන්ධ වේ (Fig. S2E).IFIT පවුලේ ප්‍රෝටීන වල ටෙට්‍රැපෙප්ටයිඩ පුනරාවර්තනය (TPR) ලෙස හැඳින්වෙන සුවිශේෂී හෙලික්ස්-ටර්න්-හෙලික්ස් මෝස්තරයක ටැන්ඩම් පිටපත් ඇත.IFIT3 RIG-I සංඥාකරණයේ ධනාත්මක මොඩියුලේටරයක් ​​සහ එබැවින් MAVS සංකීර්ණයේ අංගයක් ලෙස සොයා ගන්නා ලදී.එකට ගත් විට, අපගේ දත්ත යෝජනා කරන්නේ IFIT3 සහ DDX60 මූලික වශයෙන් IFIT3 හි TPR 3-6 අතර කලාපය තුළ අන්තර්ක්‍රියා කරන අතර RIG-I/MAVS සංඥාකරණයේ කාර්යභාරයක් ඉටු කළ හැකි බවයි (Fig. S2F).
සම්පූර්ණ ප්‍රෝටියෝමය පිරික්සීම පරිගණකමය වශයෙන් තීව්‍ර වන බැවින්, අපි IFNα-ප්‍රතිකාර කළ පුනරාවර්තනවලින් එකක් තිබීම සඳහා සම්පූර්ණ මානව UniProt දත්ත සමුදායම පරීක්ෂා කළෙමු.මෙම අනුරුවෙහි, අපට HLA-A සඳහා ඉතා විශ්වාසදායක අන්තර්ක්‍රියා ජාල කිහිපයක් හමු විය.MS/MS වර්ණාවලි මගින් හඳුනාගත් ප්‍රෝටීන් මාර්ග විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ MHC-I මත පදනම් වූ ප්‍රතිදේහජනක සැකසීම සහ ඉදිරිපත් කිරීම ඉන්ටර්ෆෙරෝන් මගින් ප්‍රේරණය කරන ලද ප්‍රධාන මාර්ගය බවයි (රූපය 3D).එබැවින්, අපි සියලු හරස්-සම්බන්ධිත සාම්පල පිළිබඳ ඉහළ විශ්වාසයකින් MHC-I අණු වල ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා අධ්‍යයනය කිරීමට අවධානය යොමු කළෙමු.HLA α1, α2 සහ α3 වසම් සහ සැහැල්ලු දාම වලින් සමන්විත වන අතර microglobulin β2 (β2m) යනු නියත chaperone protein49 වේ.එන්ඩොප්ලාස්මික් රෙටිකුලම් තුළ එකලස් කළ පසු, පෙප්ටයිඩ ලිගන්ඩ්ස් නොමැති විට එච්එල්ඒ අස්ථායී වේ.පෙප්ටයිඩ-බන්ධන වලක් සෑදී ඇත්තේ පෙප්ටයිඩ නොවන ආකාරයෙන් සහ සාපේක්ෂ වශයෙන් අඩු බහුරූපී α351 වසමෙහි අධික බහුරූපී සහ ව්‍යුහගත නොවන α1 සහ α2 වසම් මගිනි.IFNα ඉදිරියේ, අපි HLA-A සංකීර්ණ දෙකක් හඳුනා ගත්තෙමු: එකක් HMGA1 සහ H2B සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරයි (රූපය 5, වගුව S3) සහ අනෙක MDN1, LRCH4 සහ H2B සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරයි (රූපය 6).
IFNα H2B (H2BFS) සහ HMGA1 සමඟ HLA-A අන්තර්ක්‍රියා ජාලයක් ඇති කරයි.(A) H2B-HLA-A-HMGA1 සංකීර්ණයේ විවිධ ආකාරයේ අන්තර්ක්‍රියා නිරූපණය කරන 2D කුමන්ත්‍රණය (SIM-XL මෘදුකාංගයෙන් ජනනය කරන ලදී): අන්තර් සම්බන්ධකය (නිල්), අන්තර් සම්බන්ධකය (රතු) සහ තනි සබැඳිය (කළු)..විවිධ අනන්‍යතා වල වසම් වර්ණ සංකේත වේහරස්-සම්බන්ධක එළිපත්ත 3.5 ලෙස සකසා ඇත.තිත් බිම් කොටස් H2B (B) සහ HMGA1 (C) සමඟ HLA-A අන්තර්ක්‍රියා අඩවි මෙන්ම පෙප්ටයිඩ දෙක අතර K හෝ S අන්තර්ක්‍රියා අඩවි ද දක්වයි.රූපයේ, හරස් සබැඳි ලකුණු සීමාව 3.0 ලෙස සකසා ඇත.(D) PyMOL වැඩසටහනේ H2B, HLA-A, සහ HMGA1 ප්‍රෝටීන වල ව්‍යුහය තුළ පෙන්වා ඇති ප්‍රෝටීන අතර සම්බන්ධතා.මෙම ව්‍යුහයන් Phyre2 සේවාදායකය (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) භාවිතයෙන් ආදර්ශනය කරන ලද අතර H2B, HLA-A සහ HMGA1 ප්‍රෝටීන සඳහා සැකිලි ව්‍යුහයන් පිළිවෙලින් 1kx552, 1kj349 සහ 2eze55 විය.
IFNα H2B (H2BFS), MDN1 සහ LRCH4 සමඟ HLA-A අන්තර්ක්‍රියා ජාලයක් ඇති කරයි.(A) MDN1 කවයක් ලෙස නිරූපණය කරන ලද 2D අන්තර්ක්‍රියාකාරී සිතියමක (SIM-XL මෘදුකාංගයෙන් ජනනය කරන ලද) ඉදිරිපත් කරන ලද අන්තර් අණුක (රතු) සහ අන්තර් අණුක (නිල්) හරස් සබැඳි.හරස්-සම්බන්ධක එළිපත්ත 3.5 ලෙස සකසා ඇත.විවිධ අනන්‍යතා වල වසම් වර්ණ සංකේත වේ LRR_8 (137-194) සහ CH (535-641)).(B) PyMOL වැඩසටහනේ H2B, HLA-A, LRCH4, සහ MDN1 ප්‍රෝටීන වල ව්‍යුහය තුළ පෙන්වා ඇති ප්‍රෝටීන අතර සම්බන්ධතා.මෙම ව්‍යුහයන් H2B, HLA-A, LRCH4 සහ MDN1 ප්‍රෝටීන සඳහා 1kx552, 1kj349, 6hlu62 සහ 6i2665 යන සැකිලි ව්‍යුහයන් සහිත Phyre2 සේවාදායකය (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) භාවිතයෙන් ආදර්ශනය කර ඇත. පිළිවෙලින්.H2B (C), LRCH4 (D) සහ MDN1 (E) සමඟ HLA-A සඳහා K හෝ S අන්තර්ක්‍රියා අඩවි පෙන්වන තිත් බිම් කොටස්.බිම් කොටස් සඳහා, හරස් සබැඳි ලකුණු සීමාව 3.0 ලෙස සකසා ඇත.
ජෙනෝමයේ අඛණ්ඩතාව පවත්වා ගැනීමට අමතරව, පිටපත් කිරීම නියාමනය කිරීමේදී හිස්ටෝන් H2B ද සම්බන්ධ වේ.H2B ප්‍රෝටීනය සමන්විත වන්නේ මධ්‍යම හිස්ටෝන් වසමකින් (HFD) ලූප මගින් වෙන් කරන ලද α-හීලිස් තුනකින් සහ C-පර්යන්ත වලිගය 41,52 කින් සමන්විත වේ.H2B සමඟ බොහෝ අන්තර්ක්‍රියා සිදු වන්නේ α1 හීලික්ස් හි වන අතර, එය HFD heterodimer සමඟ ට්‍රයිමරීකරණය සපයයි (රූපය 5A,B).ලයිසින් DNA බන්ධනයට සම්බන්ධ වුවද, සමහර ලයිසින් විකල්ප ඇසිටිලේෂන් හෝ මෙතිලේෂන් ස්ථාන වේ.උදාහරණයක් ලෙස, H2B හි ඇති K43, K46 සහ K57 අවශේෂ සෘජු DNA බන්ධනයට සම්බන්ධ නොවන නමුත් විවිධ පශ්චාත් පිටපත් කිරීමේ වෙනස් කිරීම්වල ඉලක්ක වේ.ඒ හා සමානව, H2B හි ඇති K44, K47 සහ K57 අනෙකුත් ප්‍රෝටීන සමඟ අන්තර්ක්‍රියා ඇතුළුව IFNα ඉදිරියේ විකල්ප කාර්යභාරයක් ඉටු කළ හැකිය (රූපය 5A, B).මීට අමතරව, බාහිර වර්ණදේහ හිස්ටෝන් H2B විවිධ සෛල වර්ගවල ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාරය සක්‍රීය කරයි, ආසාදිත කාරකයන්ගෙන් හෝ හානියට පත් සෛල වලින් ලබාගත් ද්විත්ව නූල් DNA (dsDNA) කොටස් හඳුනා ගැනීමට සයිටොසොලික් සංවේදකයක් ලෙස ක්‍රියා කරයි54.DNA වෛරස් ඉදිරියේ, H2B ක්ෂය වීම IFN-β නිෂ්පාදනය සහ STAT154 පොස්පරීකරණය වළක්වයි.H2B අනෙකුත් මූලික හිස්ටෝනවලට වඩා වේගයෙන් න්‍යෂ්ටිය තුළට සහ ඉන් පිටතට ගමන් කරන බව ද ප්‍රකටය.තෝරාගත් ප්‍රතිකාර නොකළ සාම්පලවල MDN1 සහ LRCH4 සමඟ H2B අන්තර්ක්‍රියා ද නිරීක්ෂණය විය.IFNα-ප්‍රතිකාර කළ සාම්පල තුනේම සහ එක් ප්‍රතිකාර නොකළ පුනරාවර්තන නියැදියක HLA-A H2B සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කළ බව අපට පෙනී ගියේය.මෙම දත්ත පිටපත් කිරීමේ රෙගුලාසියෙන් ස්වාධීන විකල්ප කායික ශ්‍රිතයක H2B හි භූමිකාව පිළිබිඹු කරයි.
රෝග ප්‍රවර්ධනය කරන ඇමයිනෝ අම්ල වලින් පොහොසත් කුඩා නියුක්ලියෝප්‍රෝටීනයක් වන HMGA1 (ඉහළ සංචලතා කණ්ඩායම AT-Hook 1) HLA-A ආශ්‍රිතව හඳුනාගෙන ඇත.එයට ආම්ලික C-පර්යන්ත වලිගයක් සහ AT කොකු ලෙස හැඳින්වෙන වෙනස් DBD තුනක් ඇත, මන්ද ඒවා dsDNA55,56 හි AT-පොහොසත් කලාපයේ කුඩා වලකට බැඳී ඇත.මෙම බන්ධනය DNA නැමීමට හෝ කෙළින් වීමට හේතු වන අතර, කැනොනිකල් පිටපත් කිරීමේ සාධකවලට එහි සම්මුති අනුපිළිවෙලට ප්‍රවේශ වීමට ඉඩ සලසයි.C-පර්යන්ත වලිගය ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියාවලට සහ පිටපත් කිරීමේ සාධක බඳවා ගැනීමට සම්බන්ධ යැයි විශ්වාස කෙරේ, මන්ද C-පර්යන්ත මකාදැමීමේ විකෘතියන්ට පිටපත් කිරීම ආරම්භ කිරීමට නොහැකි වේ57.එපමණක් නොව, මෙම වසමෙහි kinases 58 සඳහා උපස්ථර ලෙස හැඳින්වෙන සංරක්ෂණය කරන ලද ෆොස්ෆොරයිලේෂන් අඩවි කිහිපයක් අඩංගු වේ.අපි C-පර්යන්ත වසමෙන් පිටත HMGA1 සමඟ HLA-A සහ H2B අන්තර්ක්‍රියා නිරීක්ෂණය කළෙමු, C-පර්යන්ත වසම ප්‍රධාන වශයෙන් පිටපත් කිරීමේ සාධක බන්ධනය සඳහා භාවිතා කරන බව යෝජනා කළෙමු (රූපය 5A, C).HMGA ප්‍රෝටීන ඇඩැප්ටර DNA සමඟ බන්ධනය කිරීම සඳහා histone H1 සමඟ තරඟ කරන අතර එමඟින් ප්‍රවේශ්‍යතාව වැඩි කරයි57.ඒ හා සමානව, HMGA histone H1 සමඟ තරඟයේදී DNA සම්බන්ධක DNA ඔස්සේ histone H2B සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බව පෙනේ.HMGB1 මගින් ඩෙන්ඩ්‍රිටික් සෛල තුළ HLA-A, -B, සහ -C ප්‍රකාශනය ඇති කරයි.HMGA1 HLA-A හි α1 සහ α3 වසම් සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බව අපි සොයා ගත්තෙමු, එහි 3 DBD වලින් පිටත බොහෝ අන්තර්ක්‍රියා (Figure 5A,C).අපගේ අතේ, HLA-A න්‍යෂ්ටිය තුළ ස්ථානගත වී ඇති බව සොයා ගන්නා ලදී (දත්ත පෙන්වා නැත), සහ H2B සහ HMGA1 න්‍යෂ්ටිය තුළ ද පවතින බැවින්, මෙම අන්තර්ක්‍රියා න්‍යෂ්ටිය තුළ සිදු විය හැක.H2B, HLA-A, සහ HMGA1 අතර මනින ලද විශේෂිත එකතු කිරීම් රූප සටහන 5D හි පෙන්වා ඇත.
අනෙකුත් ප්‍රෝටීන සමඟ HLA-A හි බොහෝ අන්තර්ක්‍රියා සිදුවන්නේ එහි α1 සහ α2 වසම් සහ අක්‍රමවත් C-පර්යන්ත වසම තුළය (රූපය 6).මෙම එක් උදාහරණයකින්, HLA-A LRCH4 හි අක්‍රමික N-පර්යන්ත වලිගය සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය 6A,D).LRCH4 TLR4 සක්‍රිය කිරීම සහ LPS සයිටොකයින් ප්‍රේරණය නියාමනය කරයි, එමඟින් සහජ ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාරය මොඩියුලේට් කරයි60,61.එය leucine-rich repeats (LRRs) නවයක් සහිත පටල ප්‍රෝටීනයක් වන අතර එහි ectodomain හි සංමලඩෝලින් (CH) සමලිංගික මෝස්තරයක්, පසුව transmembrane domain (TMD) 60 , 62 .CH වසම් ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා 60 මැදිහත් වන බවට වාර්තා වී ඇත.LRR සහ CH වසම් අතර ඇමයිනෝ අම්ල 300 ක පමණ දිගුවක් සාපේක්ෂව ප්‍රවේශ විය හැකි නමුත් අක්‍රමවත් වේ.ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් ජාල සහ වෙසිකියුලර් ප්‍රවාහනය 63 හි මැදිහත්කරුවන් ලෙස අක්‍රමික කලාපවල ක්‍රියාකාරිත්වය මත පදනම්ව, බොහෝ ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා අක්‍රමවත් කලාපවල සිදුවන බව අපට පෙනී ගියේය.MDN1 සමඟ අන්තර්ක්‍රියා LRR1, LRR6, CH වසම් සහ අහඹු කලාප ඇතුළුව ප්‍රෝටීනයේ දිග පුරා බෙදා හරින ලද අතර H2B ප්‍රධාන වශයෙන් CH වසම වෙත බැඳී ඇත (රූපය 6A, B).CLMS ප්‍රවේශයේ විශේෂත්වය යෝජනා කරමින් අන්තර්ක්‍රියා කිසිවක් TMJ ඇතුළත් නොවීය (රූපය 6A, B).
MDN1 HLA-A ප්‍රෝටීන් ජාලයේ කොටසක් ලෙසද හඳුනාගෙන ඇත (රූපය 6A).එය AAA ප්‍රෝටීන පවුලට අයත් වේ (විවිධ ක්‍රියාකාරකම් හා සම්බන්ධ ATPases).මෙය එකම N-පර්යන්ත AAA වසම වන අතර එය ෂඩාස්‍රාකාර වළල්ලකට සංවිධානය වී 60S 64 ribosomal උප ඒකකයෙන් එකලස් කිරීමේ සාධකය ඉවත් කරයි.dynein64,65,66 ට සමාන බව පෙනේ.මීට අමතරව, Asp/Glu පොහොසත් කලාපය MIDAS වසම (ලෝහ අයන මත යැපෙන අඩවිය) අනුගමනය කරයි.MDN1 හි විශාල ප්‍රමාණය (ආසන්න වශයෙන් ඇමයිනෝ අම්ල 5600) සහ හොඳින් අධ්‍යයනය කරන ලද ප්‍රෝටීන සමඟ එහි සීමිත සමජාතීය නිසා, මිනිසුන් තුළ එහි ව්‍යුහය සහ ක්‍රියාකාරීත්වය ගැන දන්නේ අල්ප වශයෙනි.අපි HLA-A, H2B, සහ LRCH4 MDN1 බන්ධන හවුල්කරුවන් ලෙස හඳුනාගෙන PyMol හි ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ ලෙස ඔවුන්ගේ දිශානතිය හෙළිදරව් කළෙමු (රූපය 6A,B).මෙම ප්‍රෝටීන තුන AAA වසම, dynein වැනි සම්බන්ධක වසම සහ සමහරවිට MIDAS MDN1 වසම සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරයි.පෙර වාර්තාවක, ඇමක් ප්‍රෝටීන වල සම්බන්ධතා පිරිසිදු කිරීම MDN1 histone H2B67 හා සම්බන්ධ ප්‍රෝටීනයක් ලෙස හඳුනාගෙන ඇත.මීට අමතරව, මෑතකාලීන අධ්‍යයනයකින් HCT116 සෛල තුළ MDN සහ HLA-B අතර අන්තර්ක්‍රියා වාර්තා කර ඇත්තේ අපගේ සොයාගැනීම්වලට සහය දක්වමින් සම්බන්ධිත-පිරිසිදු ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය භාවිතා කරමිනි.IFNα-ප්‍රතිකාර කළ සාම්පලවල මෙම සංකීර්ණය හඳුනාගැනීමෙන් ඉන්ටර්ෆෙරෝන් සංඥා කිරීමේදී MDN1 සඳහා භූමිකාවක් යෝජනා කරයි.
HLA ජාන ඉතා බහුරූපී බැවින්, අපි Flo-1 සෛලවල RNA අනුක්‍රමික දත්ත වලින් HLA-A, -B, සහ -C අනුක්‍රමික කියවීම් උපුටා ගත්තෙමු (දත්ත පෙන්වා නැත).අනුක්‍රමික කියවීමට අනුරූප වන පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලවල් HLA-A හි හරස් සම්බන්ධිත පෙප්ටයිඩ පිහිටා ඇති කලාපවල HLA-A, -B සහ -C අතර සැලකිය යුතු වෙනස්කම් අනාවරණය විය (රූපය S3).මීට අමතරව, අපි H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 ප්‍රෝටීන සමඟ HLA-B/C අණු වල ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් හරස් සම්බන්ධ කිරීම නිරීක්ෂණය නොකළෙමු.මෙයින් ඇඟවෙන්නේ HLA-A, MDN1, LRCH1 සහ HMGA1 අතර ඇති ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා HLA-A විශේෂිත බවයි.මීට අමතරව, HLA-B හෝ HLA-C හා සසඳන විට HLA-A හි ඉහළ අනුක්‍රමික ආවරණයක් ඇති බව Crosslinked නොවන සාම්පල (වගුව S4) ප්‍රෝටෝමික් විශ්ලේෂණය පෙන්නුම් කළේය.HLA-A සඳහා හඳුනාගෙන ඇති පෙප්ටයිඩ IFNα-ප්‍රතිකාර කළ සහ ප්‍රතිකාර නොකළ සාම්පල දෙකෙහිම තීව්‍රතාවයෙන් ඉහළ විය.
මෙහි හඳුනාගත් අන්තර්ක්‍රියා සමීප අවකාශීය සමීපයේ ඇති ප්‍රෝටීන දෙකක නිශ්චිත නොවන හරස් සම්බන්ධයක් නිසා නොවන බව සහතික කිරීම සඳහා, අපි සම-ප්‍රතිශක්තිකරණ පරීක්ෂණ සිදු කිරීමෙන් නව HLA-A අන්තර්ක්‍රියාකාරී සාධක දෙකක් තවදුරටත් තහවුරු කළෙමු.ආවේණික MDN1 සහ H2B සමඟ HLA-A අන්තර්ක්‍රියා IFNα-ප්‍රතිකාර කළ සහ ප්‍රතිකාර නොකළ Flo-1 සෛල දෙකෙහිම අනාවරණය විය (Figure 7, Figure S4).HLA-A ප්‍රතිශක්තිකරණ ක්‍රියාවලියේදී H2B මගින් ග්‍රහණය කර ඇති බවත්, ප්‍රතිකාර නොකළ සෛලවල ප්‍රතිශක්තිකරණ සාම්පලවල HLA-A නොමැති බැවින් මෙම සම්බන්ධය IFNα ප්‍රතිකාරය නිසා ඇති වූ බවත් අපි තහවුරු කළෙමු (රූපය 7A).කෙසේ වෙතත්, අපගේ දත්ත යෝජනා කරන්නේ IFNα HLA-A H2B සහ MDN1 වෙත බන්ධනය වෙනස් ලෙස නියාමනය කරන බවයි.IFNα H2B සහ HLA-A අතර සම්බන්ධයක් ඇති කරයි, නමුත් MDN1 සමඟ ඇති සම්බන්ධය අඩු කරයි.MDN1 පාලනයන්හි HLA-A සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති බව අපට පෙනී ගිය අතර, IFNα එකතු කිරීම IFNα මගින් MDN1 ප්‍රේරණයෙන් ස්වාධීනව මෙම අන්තර්ක්‍රියාව අඩු කළේය (රූපය 7B,C).මීට අමතරව, HLA-A ප්රතිශක්තිකරණය A549 සෛල තුළ H2B අල්ලා ගන්නා ලදී (Fig. S4), මෙම අන්තර්ක්රියා සෛල වර්ගයෙන් ස්වාධීන බව යෝජනා කරයි.එකට ගත් විට, මෙම ප්‍රතිඵල H2B සහ MDN1 සමඟ HLA-A හි ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-මැදිහත් වූ අන්තර්ක්‍රියා සඳහා සහාය වේ.
HLA-A H2B සහ MDN1 සම-පවිත්‍ර කරයි.නියෝජිත අන්තරාසර්ග H2B (A) සහ MDN1 (B) immunoblots IFNα-ප්‍රතිකාර කරන ලද Flo-1 සෛල වලින් ප්‍රතිශක්තිකරණය කරන ලද අතර පෙන්වා ඇති ප්‍රතිදේහ සඳහා විමර්ශනය කරන ලදී.මූසිකය සහ හාවා IgG සෘණ පාලනයක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී.(C) විවිධ ප්‍රතිදේහජනකවල සාපේක්ෂ ප්‍රමාණයන් (ආදානය) දක්වන ලද ප්‍රතිදේහවලට එරෙහිව පරීක්‍ෂා කරන ලද ප්‍රතිශක්ති බ්ලොට් මගින් නිරූපණය කෙරේ, β-ඇක්ටින් පැටවුම් පාලනයක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී.
ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-ප්‍රේරිත ඉතා විශ්වාසදායක හරස් සම්බන්ධිත ජාල වලින් එකක් වන H2B-HLA-A-HMGA1 හි ව්‍යුහාත්මක ගුණාංග විමර්ශනය කරන ලදී.මෙම සංකීර්ණයට සම්බන්ධ ප්‍රෝටීනවල අනුරූප ගතිකත්වය අවබෝධ කර ගැනීම සඳහා විකල්ප ප්‍රවේශයක් ලෙස අපි අණුක ගතික ආකෘති නිර්මාණය භාවිතා කළෙමු (රූපය 8).CLMS දත්තවල නිගමන මගින් H2B, HLA-A සහ HMGA1 ප්‍රෝටීන වල විවිධ අනුකූලතා වල හැකියාව යෝජනා කරයි.එබැවින්, පහත විභව සංකීර්ණ ද්‍රාව්‍ය මාධ්‍යයකින් ආකෘතිගත කර ඇත: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, සහ H2B-HLA-A-HMGA1.MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) පැකේජය භාවිතා කරන මූලික ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් ඩොකින් තිරයක් මෙම ප්‍රෝටීන අතර වෙනස් විය හැකි අනුකූලතා යෝජනා කළේය (රූපය 8A).ඩොකින් ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණයේ දෘශ්‍යකරණය මගින් අන්තර්ක්‍රියා කිහිපයක් සහ හැකි අනුකූලතා අනාවරණය විය (රූපය 5A, 8).මේ අනුව, හැකි එක් අනුකූලතාවයක් රූප සටහන 8A හි පෙන්වා ඇත (ලේබල් කරන ලද හරස් සබැඳි සහිත) සහ එය MD ආකෘතිකරණ නල මාර්ගය භාවිතයෙන් තවදුරටත් ඇගයීමට ලක් කරන ලදී.මීට අමතරව, H2B හෝ HMGA1 HLA-A වෙත බන්ධනය කිරීම HLA-A සඳහා H2B හි ඉහළ සම්බන්ධතාවය ඉස්මතු කරයි (රූපය 8A).
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, සහ H2B-HLA-A-HMGA1 සංකීර්ණ අතර ඇති විය හැකි ජාල වල අනුකූල ගතිකත්වය.(A) වම් පුවරුව යනු අභ්‍යන්තර අණුක (රතු) සහ අන්තර් අණුක (නිල්) හරස් සබැඳි (හරස් සබැඳි කඩඉම් 3.5 ලෙස සකසා ඇත) 2D සිතියමක් (SIM-XL මෘදුකාංගයෙන් ජනනය කර ඇත).මීට අමතරව, හඳුනාගත් හරස් සම්බන්ධක අපද්‍රව්‍ය H2B, HLA-A සහ HMGA1 ප්‍රෝටීන වල ව්‍යුහයන් මත ලේබල් කර ඇත.MOE පැකේජයේ ක්‍රියාත්මක කරන ලද ඩොකින් නල මාර්ගය භාවිතයෙන් මෙම ප්‍රෝටීන වල ආශ්‍රිත අනුකූලතා උපුටා ගන්නා ලදී.පහළ වම් පුවරුව විවිධ ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් බන්ධන සම්බන්ධතා (GBVI/WSA dG; kcal/mol) සහිත H2B-HLA-A සහ HMGA1-HLA-A සංකීර්ණවල විවිධ විය හැකි අනුකූලතා පෙන්වයි.(B) එක් එක් ප්‍රෝටීන ව්‍යුහය සඳහා පරමාණුක පිහිටුම්වල (හයිඩ්‍රජන් පරමාණු හැර) සම්මත අපගමනය (RMSD).(C) අන්තර් අණුක ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් හයිඩ්‍රජන් බන්ධන අන්තර්ක්‍රියා ≥ 10 ns කාලසීමාවෙහි නිශ්චිත අන්තර්ක්‍රියා සැලකිල්ලට ගනිමින් විවිධ සමාකරණ සංකීර්ණ වලින්.h-bond donor-acceptor කඩඉම් දුර 3.5 Å ලෙසද, donor-H-acceptor කඩඉම් කෝණය ≥ 160°–180° ලෙසද සකසා ඇත.(D) ව්‍යාජ HLA-A-H2B සහ HLA-A-HMGA1 සංකීර්ණ වලින් නිස්සාරණය කරන ලද ≥ 20 ns දක්වා විහිදෙන, HLA-A ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා සාදන ලේබල් කළ අපද්‍රව්‍ය.ප්රෝටීන් ව්යුහයන් 100 ns MDS හි සාමාන්ය ව්යුහයක් නියෝජනය කරයි.(E) HLA-A-H2B සහ HLA-A-HMGA1 සංකීර්ණ අතර අන්තර්ක්‍රියා හා සසඳන විට H2B-HLA සමාකරණය මගින් පෙප්ටයිඩ දෙක අතර K හෝ S අන්තර්ක්‍රියා අඩවිය මත පදනම්ව 100 ns ට වැඩි අන්තර්ක්‍රියා.සංකීර්ණ /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.හරස්-සබැඳි ඇගයීම සඳහා වන එළිපත්ත අගය 3.0 ලෙස සකසා ඇති අතර, MDS වෙතින් ≥ 10 ns ලබා ගන්නා විශේෂිත අන්තර්ක්‍රියා සැලකිල්ලට ගන්නා ලදී.BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) සහ Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) ඇසුරුම් භාවිතයෙන් ප්‍රෝටීන් ව්‍යුහයන් දෘශ්‍යමාන කරන ලදී.
කාලයත් සමඟ HLA-A අණු වල ස්ථායීතාවය (සම්මත අපගමනය; RMSD හෝ සම්මත අපගමනය; RMSF) H2B හෝ HMGA1 ප්‍රෝටීන සංකීර්ණ වල පැවතීම HLA-A ස්ථායී කරන බව පෙන්නුම් කරයි (Figure 8B, Figure S5).HMGA1 ප්‍රෝටීනය HLA-A හි B2M අඩවියට තදින් බැඳී, HLA-A-HMGA1 හෝ H2B-HLA-A-HMGA1 සංකීර්ණයේ HLA-A ඇමයිනෝ අම්ලවල ස්ථායීතාවය ඇති කරයි (රූපය 8B, Figure S5).විශේෂයෙන්ම, HLA අවශේෂ ~60-90 සහ ~180-210 H2B (FIG. 8B) ඉදිරියේ අඩු නම්‍යශීලී බව සොයා ගන්නා ලදී.H2B සහ HMGA1 H2B හෝ HMGA1 සමඟ පමණක් HLA-A බන්ධනයට සාපේක්ෂව H2B-HLA-A-HMGA1 සංකීර්ණයේ HLA-A වෙත වඩා හොඳ බන්ධනයක් පෙන්නුම් කරයි (රූපය 8C,D; වගුව S5).හයිඩ්‍රජන් බන්ධනයට සම්බන්ධ අපද්‍රව්‍ය (MD ආකෘතිගත ඉහළ පදිංචිය ≥ 10 ns) සංකීර්ණයේ ඇති CLMS අන්තර්ක්‍රියා අඩවි (K හෝ S අවශේෂ) සමඟ සමපාත වන අතර, CLMS විසින් හඳුනාගෙන ඇති අන්තර්ක්‍රියා ඉතා විශ්වාසදායක බව යෝජනා කරයි.විශ්වසනීයත්වය (රූපය 8E ).CLMS සහ MD ආකෘති නිර්මාණයේදී, HLA-A අවශේෂ 190-210 සහ 200-220 පමණ ඇමයිනෝ අම්ල පිළිවෙළින් H2B සහ HMGA1 බන්ධනය කරන බව සොයා ගන්නා ලදී (FIG. 8E).
ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා සමහර උත්තේජකවලට ප්‍රතිචාර වශයෙන් අන්තර් සෛලීය සන්නිවේදනයට මැදිහත් වන ගතික ව්‍යුහාත්මක ජාල සාදයි.බොහෝ ප්‍රෝටෝමික්ස් ප්‍රවේශයන් ප්‍රෝටීනයක සමස්ත ස්ථායී මට්ටමේ වෙනස්කම් හඳුනා ගන්නා නිසා, ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන අන්තර්ක්‍රියා ගතිකයට බන්ධන අතුරුමුහුණත් ග්‍රහණය කර ගැනීමට අමතර මෙවලම් අවශ්‍ය වන අතර CLMS එවැනි මෙවලමකි.ඉන්ටර්ෆෙරෝන් සංඥා පද්ධතිය යනු සෛලවලට පාරිසරික ව්‍යාධිජනක සහ ආවේණික ව්‍යාධි සංඥා පරාසයකට ප්‍රතිචාර දැක්වීමට ඉඩ සලසන සයිටොකයින් ජාලයකි, ඉන්ටර්ෆෙරෝන් ප්‍රේරණය කළ හැකි ප්‍රෝටීන වල උප කුලක ප්‍රේරණයෙන් අවසන් වේ.ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-ප්‍රේරිත ප්‍රෝටීන මණ්ඩලයක් අතර නව ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා හඳුනාගත හැකිද යන්න තීරණය කිරීමට අපි CLMS යෙදුවෙමු.ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ ග්‍රහණය කර ගැනීම සඳහා ඉන්ටර්ෆෙරෝන් ප්‍රතිචාර දක්වන Flo-1 සෛල ආකෘතියක ගෝලීය ප්‍රෝටීන හරස් සම්බන්ධක විශ්ලේෂණය භාවිතා කරන ලදී.හරස්-සම්බන්ධ නොවන සහ හරස්-සම්බන්ධිත සෛල වලින් ට්‍රිප්ටික් පෙප්ටයිඩ නිස්සාරණය කිරීම, අර්ථ දක්වා ඇති LFQ තීව්‍රතාවයෙන් පෙප්ටයිඩ ගණන් කිරීම, මාර්ග සුපෝෂණය සහ පෙප්ටයිඩ දිග බෙදා හැරීම සඳහා ඉඩ සලසයි.කැනොනිකල් ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-ප්‍රේරණය කළ හැකි ප්‍රෝටීන ධනාත්මක අභ්‍යන්තර පාලනයක් ලෙස හඳුනාගෙන ඇති අතර, MX1, UP18, OAS3 සහ STAT1 වැනි කැනොනිකල් ඉන්ටර්ෆෙරෝන් ප්‍රේරණය කළ හැකි ප්‍රෝටීන වල නව අන්තර් අණුක සහ අන්තර් අණුක හරස් සම්බන්ධිත එකතු කිරීම් නිරීක්ෂණය කරන ලදී.ක්‍රියාකාරී ක්ෂේත්‍රවල විවිධ ව්‍යුහාත්මක ලක්ෂණ සහ අන්තර්ක්‍රියා විමර්ශනය කර ඇත.
HLA-A, MDN1 සහ H2B අතර අන්තර්ක්‍රියාවක් IFNα සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද සහ ප්‍රතිකාර නොකළ Flo-1 සහ A549 සෛලවල ප්‍රතිශක්තිකරණය මගින් අනාවරණය විය.HLA-A සංකීර්ණ H2B සමඟ IFNα මත රඳා පවතින ආකාරය අපගේ ප්‍රතිඵල ඉස්මතු කරයි.අපගේ කාර්යය මෙම සංකීර්ණ දෙකෙහි සම-ප්රාදේශීයකරණය තවදුරටත් ගවේෂණය කිරීම සඳහා සිත්ගන්නා මාර්ගයක් නියෝජනය කරයි.සෛල-වර්ගය-ස්වාධීන ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-මැදිහත් ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා හඳුනා ගැනීම සඳහා සෛල රේඛා පුවරුවකට CLMS ප්‍රවේශය පුළුල් කිරීම ද සිත්ගන්නා කරුණකි.අවසාන වශයෙන්, අභ්‍යන්තර අණුක සහ අන්තර් අණුක හරස් කතා නිරීක්ෂණය කරන ලද H2BFS-HLA-A-HMGA1 සංකීර්ණයට සම්බන්ධ ප්‍රෝටීන වල අනුකූල ගතිකත්වය තේරුම් ගැනීමට විකල්ප ප්‍රවේශයක් ලෙස අපි MD ආකෘති නිර්මාණය භාවිතා කළෙමු.CLMS දත්ත වලින් ලැබෙන නිගමන මගින් H2BFS, HLA-A, සහ HMGA1 ප්‍රෝටීන වල විවිධ අනුගත වීමේ හැකියාව යෝජනා කරයි.මෙම ඩොකින් ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ අතර ඇති විය හැකි විවිධ අනුකූලතා CLMS දත්ත කට්ටලයේ නිරීක්ෂණයට සමාන අන්තර්ක්‍රියා කිහිපයක් හෙළිදරව් විය.අපගේ ක්‍රමයේ ප්‍රධාන ශක්තීන්ගෙන් එකක් නම්, HLA වැනි අන්තර්ක්‍රියා කරන අතිශය බහුරූපී ජාන පහසුවෙන් හඳුනා ගැනීමට ඉඩ සැලසීමයි, එබැවින් අධ්‍යයනය කිරීමට අපහසු HLA haplotype-විශේෂිත ප්‍රෝටීන වල අන්තර්ක්‍රියා අධ්‍යයනය කිරීම සිත්ගන්නාසුළු වනු ඇත.එකට ගත්විට, ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-ප්‍රේරිත සංඥා ජාල පිළිබඳ අපගේ අවබෝධය පුළුල් කිරීමට සහ පිළිකා ක්ෂුද්‍ර පරිසරයේ වඩාත් සංකීර්ණ අන්තර් සෛලීය පද්ධති අධ්‍යයනය කිරීමට පදනමක් සැපයීමට CLMS භාවිතා කළ හැකි බව අපගේ දත්ත පෙන්නුම් කරයි.
Flo-1 සෛල ATCC වෙතින් ලබාගෙන DMEM (Gibco) හි 1% පෙනිසිලින්/ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් (Invitrogen), 10% කලල ගව මස්තු (Gibco) සහ 37°C සහ 5% CO2 හි ගබඩා කර ඇත.ඉන්කියුබේෂන්.IFNα14 (Edinburgh Protein Production Facility විසින් නිෂ්පාදනය කරන ලද) සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමට පෙර සෛල 70-80% සංගම දක්වා වර්ධනය කරන ලදී.අනෙකුත් සියලුම රසායනික ද්‍රව්‍ය සහ ප්‍රතික්‍රියාකාරක වෙනත් ආකාරයකින් සටහන් නොකළහොත් සිග්මා ඇල්ඩ්‍රිච් වෙතින් මිලදී ගන්නා ලදී.
Flo-1 සෛල 6-ළිං තහඩු තුළ වගා කරන ලද අතර ඊළඟ දවසේ සෛල 10 ng/ml IFNα14 සමඟ පැය 24 ක් සඳහා ආසන්න වශයෙන් 80% දක්වා සංගමනය කරන ලදී.සෛල PBS සමඟ තුන් වරක් සෝදා නැවුම්ව සකස් කරන ලද DSS (Thermo Fisher Scientific) (DMSO හි දියකර) PBS හි මිනිත්තු 5ක් 37° C. ට අවසන් සාන්ද්‍රණය 0.5 mM දක්වා බන්ධනය කරන ලදී.DSS හරස් සම්බන්ධක ප්‍රතික්‍රියාව PBS සමඟ ප්‍රතිස්ථාපනය කරන ලද අතර 37 ° C දී විනාඩි 15ක් සඳහා PBS හි 20 mM Tris (pH 8.0) එකතු කිරීමෙන් අවශේෂ DSS නිවා දමන ලදී.සීරීම් මගින් සෛල එකතු කර අඩු බන්ධන නල (ඇක්සිජන්) තුළ එකතු කරන ලදී.
සෛල පෙති 300 µl යූරියා ලිසිස් බෆරය (8 M යූරියා, 0.1 M ට්‍රිස්, pH 8.5) සමඟ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 30 ක් ඉඳහිට සෙලවීමත් සමඟ ලිස් කරන ලදී.සියලුම කේන්ද්රාපසාරී පියවර 8 ° C දී 14,000 xg දී සිදු කරන ලදී.මිනිත්තු 10 ක් සඳහා ලයිසෙට් කේන්ද්‍රාපසාරී කර නව නලයකට අධි ප්‍රවාහය මාරු කරන්න.ඉතිරි පැහැදිලි අංශු, සමජාතීය ජලීය ද්‍රාවණයක් ලබා ගන්නා තෙක් මිනිත්තු 30 ක් හෝ ඊට වැඩි කාලයක් සඳහා දෙවන ලිසිස් බෆරයේ 150 μl (2 M යූරියා, 2% (w/v) SDS (සෝඩියම් ඩොඩෙසිල් සල්ෆේට්)) විසුරුවා හරින ලදී.ලයිසේට් විනාඩි 20 ක් කේන්ද්‍රාපසාරී කර ඇති අතර පෙර පියවරේදී ලබාගත් ලයිසේට් සමඟ සුපිරි නැටුම් මිශ්‍ර කර ඇත.මයික්‍රොප්ලේට් ක්‍රියා පටිපාටි සඳහා නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව ක්ෂුද්‍ර BCA විශ්ලේෂණය (Thermo Fisher Scientific) භාවිතයෙන් ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණය තක්සේරු කරන ලදී.සාම්පල ඉක්මනින් ද්රව නයිට්රජන් තුළ ශීත කළ අතර -80 ° C දී ගබඩා කර ඇත.
Wisniewski et al විසින් විස්තර කරන ලද පරිදි 100 μg පමණ ද්‍රාව්‍ය හරස්-සම්බන්ධිත ප්‍රෝටීන් වෙනස් කරන ලද පෙරීමේ සාම්පල සකස් කිරීමේ ප්‍රොටෝකෝලය (FASP) භාවිතයෙන් සකස් කරන ලදී.69 කෙටියෙන්, ප්‍රෝටීනය යූරියා බෆරය 200 µl සමඟ හරස් සම්බන්ධ කර ඇත (0.1 M ට්‍රයිස් හි යූරියා 8 M, pH 8.5), සුළි සහ අඩකින්.සියලුම කේන්ද්රාපසාරී පියවර 25 ° C දී 14,000 xg දී සිදු කරන ලදී.හරස්-සම්බන්ධිත ප්‍රෝටීන් ලයිසේට් හි පළමු භාගය Ultracel-10 පටලයකින් (Merck) සමන්විත වූ 10 kDa මයික්‍රොකොන් කේන්ද්‍රාපසාරී පෙරහන උපාංගයකට මාරු කරන ලද අතර පසුව මිනිත්තු 25ක් සඳහා පෙරහන මත කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීම සිදු කරන ලදී.ඉන්පසු ප්රෝටීනයේ දෙවන භාගය පෙරහනට එකතු කර එම පියවර නැවත නැවතත් කරන්න.යූරියා බෆරයේ 17 mM ට්‍රයිස්(2-කාබොක්සයිතයිල්) ෆොස්ෆයින් හයිඩ්‍රොක්ලෝරයිඩ් (TCEP) 100 μl එකතු කිරීමෙන් ප්‍රෝටීන ප්‍රතිසාධනය සිදු කරන ලදී.37 ° C දී විනාඩි 30 ක් සඳහා 600 rpm දී thermomixer මත ප්රතිසාධනය කලවම් කරන ලදී.මීට අමතරව, තීරුව කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලද අතර අඩු කරන ලද හරස්-සම්බන්ධිත ප්‍රෝටීනය යූරියා බෆරයේ 50 mM iodoacetamide 100 μl භාවිතා කරමින් ඇල්කයිලේට් කරන ලදී.ඇල්කයිලේෂන් ප්රතික්රියාව අඳුරේ විනාඩි 20 ක් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී සිදු කරන ලදී.තීරුව කරකවන්න, 100 µl යූරියා බෆරයකින් තීරු බිත්ති 3 වරක් සෝදන්න, ඉන්පසු කේන්ද්‍රාපසාරී කරන්න.100 mM ඇමෝනියම් බයිකාබනේට් 100 μl භාවිතා කරමින් එම මෙහෙයුම 3 වතාවක් සිදු කරන ලදී.ට්‍රයිප්සිනීකරණයට පෙර, එකතු කිරීමේ නළය නව එකක් සමඟ ප්‍රතිස්ථාපනය කරන්න.50 mM ඇමෝනියම් බයිකාබනේට් සහ ට්‍රයිප්සින් බෆරයේ (ප්‍රොමෙගා) තනුක කර ඇති ට්‍රයිප්සින් 1 μl අඩංගු ආහාර දිරවීමේ බෆරය එක් කරන්න.ට්‍රයිප්සින් සහ ප්‍රෝටීන් අනුපාතය 1:33 ට පමණ පවත්වා ගෙන ගිය අතර, ආහාර දිරවීමේ ප්‍රතික්‍රියා එක රැයකින් 37 ° C. තෙත් කුටීරයක පුර්වගත කරන ලදී.හරස් සම්බන්ධිත පෙප්ටයිඩය විනාඩි 25ක් සඳහා කේන්ද්‍රාපසාරණය මගින් පෙරහනෙන් ඉවත් කරන ලදී.ෆිල්ටරයට 0.5 M NaCl හි 50 μl එකතු කිරීමෙන් පෙප්ටයිඩ ප්‍රතිසාධනය වැඩි දියුණු කරන ලද අතර පසුව විනාඩි 25 ක් කේන්ද්‍රාපසාරී කර ඇත.
C18 Micro Spin columns (Harvard Apparatus) Bouchal et al.70 විසින් විස්තර කරන ලද ප්‍රොටෝකෝලය අනුව කුඩා වෙනස් කිරීම් සහිතව හරස්-සම්බන්ධිත ට්‍රිප්ටික් පෙප්ටයිඩ ලුණු ඉවත් කිරීමට භාවිතා කරන ලදී.කෙටියෙන් කිවහොත්, ඇසිටෝනයිට්‍රයිල් (AcN) (මර්ක්) හි 0.1% ෆෝමික් අම්ලය (FA) වොෂ් තුනක් සහ 0.1% FA සේදුම් දෙකක් සමඟ C18 ස්පින් තීරු සක්‍රීය කරන ලදී.තීරුව විනාඩි 15ක් සඳහා 0.1% FA සමඟ සජලනය කරන ලදී.නියැදි කරකැවෙන තීරුවලට පූරණය කර 0.1% FA සමඟ 3 වරක් සෝදන්න.0.1% FA හි 50%, 80% සහ 100% AcN භාවිතා කරමින් පියවරෙන් පියවර අනුක්‍රමණයක් සමඟින් ලුණු දැමූ පෙප්ටයිඩ අනුක්‍රමිකව ඉවත් කරන ලදී.අවශේෂ දියර සම්පූර්ණයෙන්ම අතුරුදහන් වන තෙක් සාම්පල SpeedVac Plus සාන්ද්‍රණයක (Eppendorf) වියලන ලදී.එලියුටඩ් පෙප්ටයිඩ 2.5% AcN හි 0.08% ට්‍රයිෆ්ලෝරෝඇසිටික් අම්ලයේ 100 μl හි දියකර ඇති අතර සාන්ද්‍රණය NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) මත මනිනු ලැබේ.නියැදියකට හරස් සම්බන්ධිත පෙප්ටයිඩ 1 μg පමණ LC-MS/MS පද්ධතියට එන්නත් කරන ලදී.
Orbitrap Exploris 480 ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයට (Thermo Scientific) සම්බන්ධ UltiMate 3000 RSLCnano LC පද්ධතියක් (Thermo Scientific) මත හරස්-සම්බන්ධිත පෙප්ටයිඩ වෙන් කරන ලදී.C18 PepMap100 sorbent සහ 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific) ඇසුරුම් කරන ලද µm 300 ID, 5 mm දිග ​​µ-පෙර තීරු C18 ග්‍රහණ තීරුව මත හරස්-සම්බන්ධිත පෙප්ටයිඩ එකතු කරන ලදී.පොම්ප ප්‍රවාහ කට්ටලය 5 µl/min 0.08% ට්‍රයිෆ්ලෝරෝඇසිටික් අම්ලය 2.5% AcN හි දියකර පටවන්න.හරස්-සම්බන්ධිත පෙප්ටයිඩ 2 μm PepMap sorbent (Thermo Scientific) පුරවා ඇති අභ්‍යන්තර විෂ්කම්භය 75 μm සහ 150 mm දිග ​​සහිත විශ්ලේෂණාත්මක විලයන සිලිකා තීරුවක් මත වෙන් කරන ලදී.ජංගම අදියර A සහ ​​B පිළිවෙලින් ජලයෙහි 0.1% FA සහ ඇසිටොනයිට්‍රයිල් හි 0.1% FA වලින් සමන්විත විය.අනුක්‍රමණය 2.5% B වලින් ආරම්භ වන අතර මිනිත්තු 90 කින් 40% B දක්වා රේඛීයව වැඩි වේ, ඊළඟ මිනිත්තු 2 තුළ 90% B දක්වා වැඩි වේ.ජංගම අදියර සංයුතිය විනාඩි 10 ක් සඳහා 90% B දී පවත්වා ගෙන ගිය අතර පසුව විනාඩි 2 කින් 2.5% B දක්වා රේඛීයව අඩු විය.ඊළඟ චක්රයට පෙර විනාඩි 8 ක් සඳහා තීරුව 2.5% B හි සමතුලිත විය.විශ්ලේෂණ තීරුවෙන් ඉවත් කරන ලද හරස්-සම්බන්ධිත පෙප්ටයිඩ නැනෝ ඉලෙක්ට්‍රොස්ප්‍රේ අයනීකරණ (NSI) ප්‍රභවයකින් අයනීකරණය කර Exploris 480 ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයට (Thermo Scientific) එන්නත් කරන ලදී.
Orbitrap Exploris 480 ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය ධනාත්මක දත්ත සහසම්බන්ධතා ආකාරයෙන් ක්‍රියාත්මක විය.m/z 350 Th සිට m/z 2000 Th දක්වා පරාසයක සිටුවම් සහිතව 120,000 විභේදනයකින් අංශ ප්‍රකාරයේදී සම්පූර්ණ ස්කෑන් කිරීමක් සිදු කරන ලදී.සාමාන්‍යකරණය කරන ලද AGC ඉලක්කය 300% ලෙස උපරිම ආදාන කාලය 50ms ලෙස සකසා ඇත.පෙප්ටයිඩ සඳහා මොනොයිසොටොපික් උච්ච හඳුනාගැනීම ස්ථාපිත කර ඇත.පූර්වගාමීන් ඉතා ස්වල්පයක් හමු වුවහොත් සීමා කිරීම් ලිහිල් කිරීමේ පරාමිතිය සත්‍ය ලෙස සකසා ඇත.පූර්වගාමියාගේ අවම අයනික ශක්තිය 5.0e3 ලෙස සකසා ඇති අතර +8 දක්වා පූර්වගාමී ආරෝපණ තත්ත්වයන් අත්හදා බැලීම්වලට ඇතුළත් කර ඇත.
දත්ත සහසම්බන්ධතා මාදිලියේ ප්‍රධාන ස්කෑන් අතර චක්‍ර කාලය තත්පර 2.5ක් ලෙස සකසා ඇත.පූර්වගාමී අයනයේ පළමු ඛණ්ඩනයට පසුව ගතික ස්කන්ධ බැහැර කිරීම තත්පර 20 ට සකසා ඇත.පූර්වගාමී හුදකලා කවුළුව 2 Th ලෙස සකසා ඇත.ස්ථාවර ඝට්ටන ශක්ති මාදිලියක් සහිත සාමාන්‍යකරණය වූ ඝට්ටන ශක්ති වර්ගය දත්ත මත යැපෙන MS/MS ස්කෑන් එකකදී තෝරා ගන්නා ලදී.ඝට්ටන ශක්තිය 30% දක්වා සකසා ඇත.Orbitrap විභේදනය 15,000 ට සහ AGC ඉලක්කය 100% ලෙස සකසා ඇත.අභිරුචි උපරිම එන්නත් කාලය මිලි තත්පර 60 දක්වා සකසා ඇත.
හරස්-සම්බන්ධිත සාම්පලවල ප්‍රෝටීන්-ප්‍රෝටීන් ජාලය හඹා යාමට පෙර, අපි සාම්පලවල සොයා ගත හැකි පෙප්ටයිඩ/ප්‍රෝටීන හඳුනා ගැනීමට MaxQuant පැකේජය (අනුවාදය 1.6.12.0) 26,27 භාවිතා කරමින් අමු ගොනු සකස් කළෙමු.මීට අමතරව, IFNα සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද සහ ප්‍රතිකාර නොකළ හරස් සම්බන්ධ නොකළ Flo-1 සාම්පල මත සමාන ප්‍රෝටෝමික් විශ්ලේෂණයන් සිදු කරන ලදී.MS/MS දත්ත UniProt මානව දත්ත ගබඩාවේ (www.uniprot.org) (2020 අගෝස්තු 12 උඩුගත කරන ලදී, ඇතුළත් කිරීම් 75,093 අඩංගු වේ) ඇන්ඩ්‍රොමීඩා 27 සෙවුම් යන්ත්‍රය භාවිතයෙන් සෙවිය.එන්සයිමයේ විශේෂත්වය සහ deamidation (N, Q) සහ ඔක්සිකරණය (M) වල විවිධ වෙනස් කිරීම් නොපෙන්වමින් සෙවීම සිදු කරන ලදී.පූර්වගාමී ස්කන්ධ ඉවසීම 20 ppm ලෙසත් නිෂ්පාදන අයන 0.02 Da ලෙසත් සකසා ඇත.ආරම්භක සහ උපරිම ස්කන්ධ අපගමනය 10 ppm ලෙස සකසා ඇත.පෙප්ටයිඩයේ උපරිම ස්කන්ධය Da 4600 ලෙස සකසා ඇති අතර අනුක්‍රමික සමානතාවය ඇමයිනෝ අම්ල 7 සහ 25 අතර (aa) දක්වා ඇත.පර්සියස් වැඩසටහන (අනුවාදය 1.6.10.45) භාවිතයෙන් වැඩිදුර සංඛ්‍යාන විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.ප්‍රෝටීන වල වර්ණාවලි තීව්‍රතාවය සාමාන්‍යකරණය කිරීමෙන් ප්‍රෝටීන් අන්තර්ගතය ගණනය කරන ලදී (LFQ තීව්‍රතාවය; ලේබල් නොකළ ප්‍රමාණකරණය)27 සහ තීව්‍රතා අගයන් Log2 බවට පරිවර්තනය කරන ලදී.ඒවායේ පෙප්ටයිඩ තීව්‍රතාවයෙන් හඳුනාගත් ප්‍රෝටීන වල ධූරාවලි පොකුරු R (v 4.1.2) හි ඇති pheatmap (v1.0.12) ඇසුරුම භාවිතයෙන් ගොඩනගා ඇත.IFNα-ප්‍රතිකාර කරන ලද ප්‍රෝටීන සඳහා ප්‍රතික්‍රියා මාර්ග දත්ත සමුදාය භාවිතයෙන් මාර්ගය පොහොසත් කිරීමේ විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලද අතර ඒවා ප්‍රතිකාර නොකළ සාම්පල හා සසඳන විට හතර ගුණයකට වඩා සක්‍රිය විය.
LC-MS/MS මගින් අධීක්ෂණය කරන ලද ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණවල ලයිසීන් (K) හෝ සෙරීන් (S) විශේෂිත රසායනික හරස් සම්බන්ධතා හඳුනා ගැනීම හරස් සම්බන්ධිත පෙප්ටයිඩ (SIM-XL) සඳහා වර්ණාවලීක්ෂ හඳුනාගැනීමේ යන්ත්‍රයක් (SIM-XL) භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී.පළමුව, ඉන්ටර්ෆෙරෝන් ආශ්‍රිත (IFN) DNA හානි ප්‍රතිරෝධක අත්සන (IRDS) ජාන අතර ඇති විය හැකි අන්තර්ක්‍රියා, Padariya et al.28 හි විස්තර කර ඇති IRDS ප්‍රෝටීන් දත්ත කට්ටලය භාවිතයෙන් විමර්ශනය කරන ලදී.IFNα-ප්‍රතිකාර කළ පුනරාවර්තනවලට එරෙහිව සමස්ත මානව UniProt හි සියලු කොන්දේසි සහ පුනරාවර්තන පරීක්‍ෂා කිරීම පරිගණකමය වශයෙන් තීව්‍ර වේ, එබැවින් සම්පූර්ණ මානව UniProt දත්ත ගබඩාව (www.uniprot.org) (2020 අගෝස්තු 12 බාගත කර ඇත, ඇතුළත් කිරීම් 75,093 ක් අඩංගු වේ).ඉහළ විශ්වාසනීය අන්තර්ක්‍රියා සඳහා පෙරහන් වලින් එකකි.ලබාගත් මෙම ඉහළ වැදගත්කමේ අන්තර්ක්‍රියා සියලු පුනරාවර්තන සහ කොන්දේසි යටතේ පුළුල් කර පරීක්‍ෂා කරන ලදී.
SIM-XL හි, Crosslinker (XL) සඳහා DSS භාවිතා කරන ලද අතර XL බර මාරුව සහ වෙනස් කිරීමේ බර මාරුව පිළිවෙලින් 138.06 සහ 156.07 ලෙස සකසා ඇත.පහත දැක්වෙන හරස් සම්බන්ධක ප්‍රතික්‍රියා අඩවි සැලකේ: KK, KS සහ KN-TERM, වාර්තාකරු අයන නොමැතිව.පූර්වගාමියා සහ ඛණ්ඩනය ppm යන දෙකම 20 ලෙසත් Xrea එළිපත්ත 0.15 ලෙසත් සකසා ඇත.ට්‍රිප්සින් සම්පූර්ණයෙන්ම විශේෂිත ලෙස සලකනු ලැබූ අතර අධි ශක්ති C-trap (HCD) ඛණ්ඩනය කිරීමේ ක්‍රමයක් ක්‍රියාත්මක කරන ලදී.XCorr ගතික DB අඩු කිරීමේ සීමාව සහ ගතික DB අඩු කිරීම සඳහා අවම පෙප්ටයිඩ ගණන පිළිවෙලින් 2.5 සහ 2 ලෙස සකසා ඇත.අනෙකුත් පරාමිති වන්නේ: මොනොයිසොටෝප් සම්භාවිතාව සහ උච්ච අහඹු සිදුවීම, අවම වශයෙන් 4 AA අපද්‍රව්‍ය සහ උපරිම නූල් ආරෝපණය, සහ මග හැරුණු බෙදීම්වල උපරිම 3.එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස මැහුම් කරන ලද 2D සිතියම් (SIM-XL) තුළ විශ්ලේෂණය කරන ලද අතර 2D සිතියම් තැනීම සඳහා xQuest28 චිත්‍රක නිරූපණය භාවිතා කරන ලදී.ප්‍රෝටීන් ව්‍යුහයන් මත ප්‍රෝටීන් හරස් සබැඳි PyMol (PyMOL අණුක ග්‍රැෆික් පද්ධතිය, අනුවාදය 2.0 Schrödinger, LLC) හි සපයා ඇත.
Phyre2 සේවාදායකය (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 භාවිතා කරමින් ප්‍රෝටීන් ආකෘති ව්‍යුහයන් නිර්මාණය කරන ලද්දේ සමලිංගික ආකෘති නිර්මාණය සහ "සැඟවුණු මාර්කොව් ක්‍රමය" ක්‍රියාත්මක කිරීමේ මූලධර්ම භාවිතා කරමිනි.Phyre2 දන්නා ප්‍රෝටීන ව්‍යුහයන් සමඟ අනුක්‍රමික පෙළගැස්ම මත පදනම්ව ආකෘති ව්‍යුහයන් ජනනය කරයි.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, සහ MDN1 ප්‍රෝටීන සඳහා, සැකිලි ව්‍යුහයන් 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, සහ 6i2665 භාවිතා කරන ලදී.මීට අමතරව, AlphaFold71 MX1, UBP18 සහ ROBO1 හි ව්‍යුහය ද සලකා බලන ලදී.BIOVIA Discovery Studio Visualizer පැකේජය (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) සහ Molecular Operating Environment පැකේජය (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) භාවිතයෙන් ප්‍රෝටීන් ව්‍යුහය දෘශ්‍යමාන කරන ලදී.