ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 රසායනික කර්මාන්තය සඳහා ඩුප්ලෙක්ස් වෑල්ඩින් කරන ලද නළය රසායනික සංරචකය, SPECC1L හි ඌනතාවය බෙදුණු සන්ධිවල ස්ථායීතාවය වැඩි කිරීමට සහ හිස්කබලේ ස්නායු ලාංඡන සෛල වැගිරීම අඩු කිරීමට හේතු වේ.

Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ සීමිත CSS සහය ඇති බ්‍රවුසර අනුවාදයක් භාවිතා කරයි.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන කළ බ්‍රවුසරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා ප්‍රකාරය අක්‍රිය කරන්න).ඊට අමතරව, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාසිතා සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය පෙන්වමු.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 රසායනික කර්මාන්තය සඳහා ඩුප්ලෙක්ස් වෑල්ඩින් ටියුබ්

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.මල නොබැඳෙන වානේ මැහුම් රහිත පයිප්ප, දීප්තිමත් ඇනෙල්ඩ් ටියුබ්, බාධාවකින් තොරව දඟර සහිත නල ආදිය සඳහා විශේෂිත වූ ප්රමුඛතම නිෂ්පාදකයෙකි.පාරිභෝගිකයින්ට පහසුකම් සැලසීම සඳහා, අපි වෑල්ඩින් කරන ලද පයිප්ප සහ නල ද ඇත.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.වඩාත්ම දියුණු නිෂ්පාදන සහ පරීක්ෂණ උපකරණ ඇත.අපට ඔබගේ අවශ්‍යතාවය සම්පුර්ණයෙන්ම තෘප්තිමත් කළ හැක.සම්මතයට අනුව, අප විසින් නිපදවන ලද නල සෑම විටම නිවැරදි OD සහ WT ඉවසීම ඇත.ඉවසීමේ පාලනය ප්‍රමිතීන්ට දැඩි ලෙස අනුකූල වේ.අපගේ නිෂ්පාදන සෑම විටම පාරිභෝගිකයින් සමඟ සෑහීමකට පත්වේ.අපගේ නිෂ්පාදන මිලදී ගත් පාරිභෝගිකයින් වැඩි ලාභයක් උපයා ඇත.
a) OD (පිටත විෂ්කම්භය): 3.18mm සිට 101.6mm
b) WT (බිත්ති ඝනකම): 0.5mm සිට 20mm
ඇ) දිග : පාරිභෝගිකයාගේ අවශ්යතාවය අනුව
ඈ) ප්රමිති : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ආදිය
e) ක්‍රියාවලි ක්‍රමය: ERW, EFW ආදිය

එක් ස්ලයිඩයකට ලිපි තුනක් පෙන්වන ස්ලයිඩර්.ස්ලයිඩ හරහා ගමන් කිරීමට පසුපස සහ ඊළඟ බොත්තම් භාවිතා කරන්න, එක් එක් විනිවිදක හරහා ගමන් කිරීමට අවසානයේ ඇති ස්ලයිඩ පාලක බොත්තම් භාවිතා කරන්න.
හිස් කබල ස්නායු ලාංඡන සෛල (CNCC) කලල ස්නායු නැමීම් ඉවත් කර ෆරින්ජියල් ආරුක්කු වෙත සංක්‍රමණය වන අතර එය බොහෝ මැද මුහුණත ව්‍යුහයන් සාදයි.CNCC අක්‍රිය වීම සාමාන්‍ය සහජ විකෘතියක් වන orofacial cleft හි හේතු විද්‍යාවේ වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි.විෂමජාතීය SPECC1L විකෘති විකෘති සහ සින්ඩ්‍රොමික් ඉරිතැලීම් ඇති රෝගීන් තුළ සොයාගෙන ඇත.මෙහිදී, සංස්කෘත SPECC1L knockdown සෛල තුළ කැනොනිකල් ඇලවුම් හන්දි (AJ) සංරචක, β-catenin සහ E-cadherin වැඩිදියුණු කළ පැල්ලම් අපි වාර්තා කරමු, සහ ඉලෙක්ට්‍රෝන මයික්‍රොග්‍රාෆ් AJ හි අග්‍ර-පාදක විසරණය පෙන්වයි.Craniofacial morphogenesis හි SPECC1L හි කාර්යභාරය තේරුම් ගැනීමට, අපි Specc1l ඌනතාවයෙන් යුත් මූසික ආකෘතියක් නිර්මාණය කළෙමු.සමලිංගික විකෘති කළල මාරාන්තික වන අතර ආබාධිත ස්නායු නල වැසීම සහ CNCC ලැමිනේෂන් ප්‍රදර්ශනය කරයි.විකෘති ස්නායු නැමීම් වලදී AJ ප්‍රෝටීන් පැල්ලම් වැඩි වේ.මෙම AJ දෝෂය AJ විසුරුවා හැරීම අවශ්‍ය වන CNCC delamination හි දෝෂයකට අනුකූල වේ.මීට අමතරව, Specc11 විකෘති PI3K-AKT සංඥා අඩු කර ඇපොප්ටෝසිස් වැඩි කර ඇත.වයිට්‍රෝ තුළ, වල් වර්ගයේ සෛල තුළ PI3K-AKT සංඥා වල මෘදු නිෂේධනය AJ වෙනස්කම් ඇති කිරීමට ප්‍රමාණවත් විය.වැදගත් ලෙස, SPECC1L knockdown මගින් ඇති කරන ලද AJ වෙනස්කම් PI3K-AKT මාර්ගය සක්‍රිය කිරීමෙන් ආපසු හැරවිය හැක.එකට ගත් විට, මෙම දත්ත යෝජනා කරන්නේ SPECC1L, PI3K-AKT සංඥා සහ AJ ජීව විද්‍යාවේ නව නියාමකයෙකු ලෙස, ස්නායුක නල වැසීම සහ CNCC ස්තරීකරණය සඳහා අවශ්‍ය බවයි.
Cranial neural crest සෛල (CNCCs) පෘෂ්ඨීය neuroectoderm වෙත ස්ථානගත වන අතර, අපිච්ඡද-මෙසෙන්චයිමල් සංක්‍රාන්තිය (EMT) 1,2,3 සම්බන්ධ ක්‍රියාවලියක් හරහා වර්ධනය වන ස්නායුක නැමීම්වල ස්නායු පිට්ටීලියම් වලින් වෙන් වේ.Premigrating epithelial CNCCs අන්තර් සෛලීය හන්දි කඩාකප්පල් කරන අතර පළමු සහ දෙවන ෆරින්ජියල් ආරුක්කු පුරවන සහ හිස්කබලේ කාටිලේජයෙන් වැඩි කොටසක් සාදන සංක්‍රමණික මෙසෙන්චයිමල් CNCC බවට පත්වේ.මේ අනුව, CNCC ක්‍රියාකාරිත්වය නියාමනය කරන ජාන බොහෝ විට ක්‍රේනියෝෆේසියල් සංජානනීය විෂමතාවල හේතු විද්‍යාවේදී බාධා ඇති කරයි, සාමාන්‍යයෙන් එක්සත් ජනපදයේ පමණක් උපත් 1/800 කට බලපායි.උපන් විකෘති වලින් එකක්8.
මීයන්ගේ කලල විකසනයේ දින 8.5 ත් 9.5 ත් අතර පෙර ස්නායු නාලය වැසීමත් සමග CNCC හි delamination සමපාත වේ.Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, සහ Pdgfrα12 ඇතුළුව මවුස් ඔරොෆැසියල් ක්ලෙෆ්ට්-ආශ්‍රිත ජාන ගණනාවක විකෘතියන් ද යම් ආකාරයක ස්නායු නල දෝෂයක් ප්‍රදර්ශනය කරයි.කෙසේ වෙතත්, ස්ප්ලොච් විකෘති මූසිකය (පැක්ස් 3) සීඑන්සීසී ස්තරීකරණයට හෝ සංක්‍රමණයට කිසිදු බලපෑමක් නොමැතිව ස්නායු නල වසා දැමීමේ දෝෂ ප්‍රදර්ශනය කරන බැවින්, ස්නායුක නල වසා දැමීමේ සහ සීඑන්සීසී ස්තරීකරණයේ ක්‍රියාවලීන් ස්වාධීන ලෙස සැලකිය හැකිය.CNCC විච්ඡේදනය සහ ස්නායු නල වසා දැමීමේ දෝෂ සහිත අතිරේක මූසික ආකෘති මෙම ක්‍රියාවලි දෙකෙහි පොදු අණුක පදනම නිරූපණය කිරීමට උපකාරී වේ.
Neuroepithelial සෛල වලින් CNCC හුදකලා කිරීම සඳහා ඇලවුම් හන්දි (AJs) විසුරුවා හැරීමට අවශ්‍ය වන අතර, ඒවා අතර, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin සහ α-actinin අඩංගු ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ වලින් සමන්විත වේ. අධික ප්‍රකාශන අධ්‍යයනයන් මගින් ස්නායුක නැමීම් වල E-caderin CNCC delamination හි අඩුවීමක් හෝ ප්‍රමාදයක් පෙන්නුම් කරයි.ප්‍රතිවිරුද්ධව, E-caderin මර්දනය කිරීම මුල් ස්තරීකරණයට හේතු වේ15,16.CNCC ස්තරීකරණයේදී EMT මැදිහත් වන බොහෝ සාධක වන්නේ පිටපත් කිරීමේ සාධක (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) සහ matrix metalloproteinases (MMPs) වැනි බාහිර සෛල අනුකෘති (ECM) ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමේ ප්‍රෝටීන වේ, කෙසේ වෙතත් CNcytoskeles ඍජු AJCC නියාමක වේ. තවම දන්නේ නැහැ.PI3K-AKT මාර්ගය E-caderin මට්ටම් වලට විරුද්ධ වන බව ප්‍රකටය, ප්‍රධාන වශයෙන් පිළිකා පර්යේෂණ වලින්17.මෑත අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ මීයන් තුළ PDGFα මත පදනම් වූ PI3K-AKT සංඥාව අහිමි වීම, ඉරිතැලීම් සහ ස්නායු නාල දෝෂ ඇතුළු හිස් කබලේ අසාමාන්‍යතා ඇති කරන බවයි.කෙසේ වෙතත්, PI3K-AKT මාර්ගය සහ CNCC ස්ථරීකරණය මත AJ ස්ථාවරත්වය අතර සම්බන්ධය අපැහැදිලි ය.
අපි කලින් SPECC1L හඳුනා ගත්තේ මුඛයේ සිට ඇස දක්වා විහිදී යන දරුණු ඉරිතැලීමක් ඇති පුද්ගලයන් දෙදෙනකුගේ පළමු විකෘති ජානය ලෙසයි.SPECC1L විකෘති ස්වයංක්‍රීය ආධිපත්‍යය සහිත Opitz G/BBB සින්ඩ්‍රෝමය (OMIM #145410) සහිත බහු පරම්පරාවේ පවුල් දෙකක හඳුනාගෙන ඇත, එහි බලපෑමට ලක් වූ පුද්ගලයන් අධි දුර සහ තොල් පැලීම/තල්ල ප්‍රදර්ශනය කළ අතර, එක් පවුලක Tibi overdistance syndrome (OMIM #1245454545) .Opitz G/BBB සින්ඩ්‍රෝමය ඇති අවස්ථා වලින් අඩකට වඩා X-සම්බන්ධිත (OMIM #300000) වන අතර ක්ෂුද්‍ර නාල ආශ්‍රිත සෛල ඇටසැකිල්ලේ ප්‍රෝටීන් 22 කේතනය කරන MID1 ජානයේ විකෘති වීම නිසා ඇතිවේ.අපි උපකල්පනය කරන්නේ SPECC1L, ක්ෂුද්‍ර ටියුබල් සහ ඇක්ටින් සයිටොස්කෙලිටන් හා සම්බන්ධ ප්‍රෝටීනයක් ද, සෛල ඇලවීම සහ සංක්‍රමණය අතරතුර ඇක්ටින් සයිටොස්කෙලිටන් ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම සඳහා අවශ්‍ය සංඥා මධ්‍යස්ථ කළ හැකි බවයි.in vitro සහ in vivo අධ්‍යයන හරහා, අපි දැන් PI3K-AKT සංඥා හරහා AJ ස්ථායීතාවයේ නව නියාමකයෙකු ලෙස SPECC1L විස්තර කරමු.සෛලීය මට්ටමේදී, SPECC1L ඌනතාවයෙන් pan-AKT ප්‍රෝටීන් මට්ටම අඩු වූ අතර AKT මාර්ගයෙහි රසායනික සක්‍රීය කිරීම මගින් ඉවත් කරන ලද AJ හි අග්‍ර-පාදක විසුරුම වැඩි විය.vivo හි, Specc11-අඩුපාඩු කළල දුර්වල වූ ස්නායු නල වැසීම සහ CNCC විච්ඡේදනය අඩු කිරීම පෙන්නුම් කරයි.මේ අනුව, SPECC1L සාමාන්‍ය CNCC ක්‍රියාකාරීත්වය සඳහා අවශ්‍ය ෆේෂල් මෝර්ෆොජෙනසිස් තුළදී අධික ලෙස නියාමනය කරන ලද සෛල ඇලවුම් පාදක සංඥා ක්‍රියා කරයි.
සෛලීය මට්ටමින් SPECC1L හි භූමිකාව සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා, අපි SPECC1L18 හි කලින් විස්තර කළ ස්ථායී ඔස්ටියෝසාර්කෝමා සෛල රේඛාව U2OS ඌනතාවය භාවිතා කළෙමු.SPECC1L (kd) knockdown සහිත මෙම ස්ථායී U2OS සෛලවල SPECC1L පිටපත් සහ ප්‍රෝටීන මට්ටම්වල මධ්‍යස්ථ (60-70%) අඩුවීමක් ඇති අතර, ඇක්ටින් සයිටොස්කෙලිටන් සංක්‍රමණයේ සහ ප්‍රතිසංවිධානය කිරීමේ දෝෂ සමඟ 18. ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, දැඩි තාවකාලික අඩුවීමක් SPECC1L මයිටොටික් දෝෂ වලට තුඩු දෙන බව පෙන්වා දී ඇත 23 .තවදුරටත් ගුනාංගීකරනය කිරීමේදී, අපගේ ස්ථායී SPECC1L-kd සෛල ඉතා ඉහල සංඝටනයකදී රූප විද්‍යාව වෙනස් කරන බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය 1).තනි තනි පාලන සෛල සහ අඩු සංඝටකයේ kd සෛල සමාන විය (රූපය 1A,D).විලයනයෙන් පැය 24කට පසුව, පාලන සෛල ඒවායේ කියුබොයිඩ් හැඩය (රූපය 1B, E) රඳවා ගත් අතර, SPECC1L-kd සෛල දිගු විය (රූපය 1C, F).සෛල හැඩයේ මෙම වෙනස්වීමේ ප්‍රමාණය පාලක සෛල සහ kd සෛල (චිත්‍රපටය 1) හි vivo සජීවී රූප මගින් ග්‍රහණය කර ගන්නා ලදී.සංඝටක සෛල තුළ SPECC1L හි කාර්යභාරය තීරණය කිරීම සඳහා, අපි මුලින්ම එහි ප්රකාශනය පරීක්ෂා කළෙමු.විලයනය මත SPECC1L ප්‍රෝටීන් මට්ටම් වැඩි වූ බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය 1G), නමුත් SPECC1L පිටපත් මට්ටම් වැඩි නොවීය (රූපය 1H).මීට අමතරව, සෛල ඝනත්වය වැඩි වීමත් සමග, SPECC1L ප්‍රෝටීන් අන්තර් සෛලීය මායිම්වල (රූපය 2A-E) එකතු වී, පටල ආශ්‍රිත β-කැටෙනින් (රූපය 2A'-E') සමඟ අතිච්ඡාදනය වන රටාවක් ඇත.SPECC1L සහ Actin cytoskeleton 18,23 සමඟ ඇති සම්බන්ධය අනුව SPECC1L ඇක්ටින්-පාදක ඇලවුම් හන්දි (AJ) සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බව අපි උපකල්පනය කළෙමු.
(AF) SPECC1L knockdown (DF) සෛල පාලන U2OS සෛල (AC) හා සසඳන විට ඉහළ සංඝටකයේ (F) දිගු වේ.විවිධ සෛල ඝනත්වය සඳහා අප තෝරාගත් කාල ලක්ෂ්‍ය හයෙන් තුනක් (T1, T3, T6) මෙහි පෙන්වා ඇත.(G) SPECC1L ප්‍රෝටීනය පාලන සෛලවල අඩු සංඝටක මට්ටමට සාපේක්ෂව ඉහළ සංඝටක මට්ටමකින් ස්ථායී වී ඇති බව පෙන්වන Western blot විශ්ලේෂණය.SPECC1L හි බටහිර බ්ලොට් අපේක්ෂිත 120 kDa කලාපය සහ ඉහළ අණුක බර කලාපයක් පෙන්වයි, සමහර විට පශ්චාත් පරිවර්තන ලෙස වෙනස් කළ (*).පහත් සහ ඉහළ සංඝටක සඳහා එම කොන්දේසි යටතේම වෙස්ටර්න් බ්ලොට් විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.SPECC1L පහත් සහ ඉහළ සන්ධිස්ථානයක් පෙන්වන පින්තූර එකම බ්ලොට් එකෙන් ගන්නා ලදී.එම පැල්ලම ඉවත් කර β-ඇක්ටින් ප්‍රතිදේහය සමඟ නැවත පරීක්ෂා කරන ලදී.(H) ප්‍රමාණාත්මක RT-PCR විශ්ලේෂණය SPECC1L පිටපත් මට්ටම්වල සැලකිය යුතු වෙනස්කම් නොපෙන්වයි.දෝෂ තීරු ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් හතරකින් SEM නියෝජනය කරයි.
(AE) අපි SPECC1L knockdown (kd) සමඟ සෛල හැඩ විශ්ලේෂණය සහ U2OS සෛලවල AJ වෙනස්කම් සාමාන්‍යකරණය කිරීම සඳහා සෛල ඝනත්ව පරාසයක් නියෝජනය කරන කාල ලක්ෂ්‍ය හයක් (T1-T6) තෝරා ගත්තෙමු.මෙම කාල ලක්ෂ්‍යවල පළමු පහට තනි සෛල (T1), කුඩා සෛල පොකුරු 50-70% විලයනය (T2), kd සෛල නැවත සකස් නොකර විලයනය (T3), kd සෛල නැවත හැඩගැන්වීම (T4) සහ පැය 24 වෙනස්කම් ඇතුළත් විය.kd (T5) සෛලවල පසුපස ස්වරූපයෙන්.SPECC1L ප්‍රෝටීනය ප්‍රධාන වශයෙන් T1 (A) හි සයිටොප්ලාස්මයේ විසිරී ඇත, නමුත් එහි සමුච්චය පසුකාලීන කාල ලක්ෂ්‍යවල (B-E, ඊතල) අන්තර් සෛලීය මායිම් වලදී නිරීක්ෂණය විය.(FJ) β-catenin AJ සංකීර්ණයට සම්බන්ධ අන්තර් සෛලීය මායිම්වල සමාන සමුච්චයක් පෙන්නුම් කරයි.(A'-E') SPECC1L සහ β-catenin ඉහළ සෛල ඝනත්වයෙන් (ඊතල) සෛල මායිම්වල අතිච්ඡාදනය වන පැල්ලම් පෙන්වයි.(F'-J') SPECC1L-kd සෛල තුළ, අඩු සෛල ඝනත්වයකදී (F'-H') β-කැටෙනින් පැල්ලම් සාමාන්‍ය ලෙස දිස්වන නමුත් සෛල හැඩය වෙනස් වන විට (I', J'; ඊතල) ප්‍රසාරණය වන බව පෙන්නුම් කරයි. වෙනස් වී ඇත.බාර් = 10 µm.
අපි පසුව AJ මත SPECC1L ඌනතාවයේ බලපෑම තීරණය කිරීමට උත්සාහ කළෙමු.අපි කැනොනිකල් සංරචක F-actin, myosin IIb, β-catenin, සහ E-cadherin24,25,26,27 ඇතුළු AJ-ආශ්‍රිත සලකුණු කිහිපයක් භාවිතා කළෙමු.කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි SPECC1L-kd සෛල තුළ Actin ආතති තන්තු වැඩි විය (රූපය 3A,B) 18 .ඇක්ටින් සූතිකා හා සම්බන්ධ Myosin IIb vitro හි SPECC1L-kd සෛලවල සමාන වැඩි වීමක් පෙන්නුම් කළේය (රූපය 3C,D).AJ-ආශ්‍රිත β-catenin සෛල පටලයේ ඇති කැදරින් සමඟ බන්ධනය වන අතර, පාලන කියුබෝසයිට් වල සාමාන්‍ය "පැණි වද" ප්‍රකාශන රටාවක් පෙන්වයි (රූපය 3E,G).සිත් ඇදගන්නාසුළු ලෙස, සමතලා රූපවල confocal අන්වීක්ෂය භාවිතයෙන්, β-catenin (Fig. 3E,F) සහ E-cadherin (Fig. 3G,H) සංඝටක SPECC1L-අඩුපාඩු සහිත සෛලවල සෛල පටලය මත පැල්ලම් කිරීම, විස්තීර්ණ පැල්ලම් වල කැපී පෙනෙන රටා පෙන්නුම් කරයි.Kd සෛල තුළ AJ-ආශ්‍රිත β-කැටෙනින් වර්ණ ගැන්වීමේ මෙම ප්‍රසාරණය සංගමයේදී වඩාත් ප්‍රකාශ විය, නමුත් සෛල හැඩයේ වෙනස්කම් වලට පෙරාතුව පෙනී ගියේය (රූපය 2F-J, F'-J').මෙම දිගු කරන ලද AJ පැල්ලම් වල භෞතික ස්වභාවය තීරණය කිරීම සඳහා, අපි සම්ප්‍රේෂණ ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂය (TEM) මගින් SPECC1L-kd U2OS සෛලවල අග්‍ර-පාදක මතුපිට සෛල මායිම් පරීක්ෂා කළෙමු (රූපය 3I,J).AJ (ඊතල) දැක්වෙන වෙනම ඉලෙක්ට්‍රෝන ඝනත්ව කලාප ඇති පාලන සෛලවලට ප්‍රතිවිරුද්ධව (රූපය 3I), apicobasal තලය දිගේ AJ පෙන්නුම් කරන ඉහළ ඉලෙක්ට්‍රෝන ඝනත්වයකින් යුත් විශාල, සමීප කලාප පෙන්වයි..මීට අමතරව, තීර්යක් කොටස් මත, අපි kd සෛලවල විස්තීර්ණ සෛල පටල නැමීම් නිරීක්ෂණය කළෙමු (Fig. S1A,B), එය β-catenin සහ E-cadherin staining bands (Fig. 3F,H) වල විස්තීරණ රටාව පැහැදිලි කරයි.AJs හි SPECC1L හි භූමිකාවට සහය දැක්වීම සඳහා, β-catenin සංඝටක U2OS සෛලවල ලයිසේට් වල SPECC1L සමඟ සම-ප්‍රතිශක්තිකරණය කරන ලදී (රූපය 3K).AJ සලකුණු සඳහා දීර්ඝ කරන ලද ප්‍රතිශක්තිකරණය සමඟින්, TEM විශ්ලේෂණය SPECC1L ඌනතාවය AJ අග්‍ර-පාදක ඝනත්වය සහ විචලනය වැඩි කරයි යන අපගේ උපකල්පනයට අනුකූල විය.
(AH) පැය 48 ක පශ්චාත් විලයනයේදී (T6; A, B) kd සෛල තුළ F-actin පැල්ලම් වැඩි වීම.F-actin (C, D) සමඟ සම්බන්ධ වූ myosin IIb වෙනස් කළ පැල්ලම්.SPECC1L-kd (F, H) සෛල තුළ පාලන සෛල (E, G) තුළ β-catenin සහ E-caderin පටල වර්ණ ගැන්වීමේ සුමට රටාව වැඩිදියුණු කරන ලදී.බාර් = 10 µm.(I-J) අග්‍ර-පාදක අන්තර් සෛලීය හන්දිය නිරීක්ෂණය කරන ඉලෙක්ට්‍රෝන ක්ෂුද්‍ර ග්‍රැෆි.පාලන සෛල ඇලෙන සුළු හන්දි (I, ඊතල) පෙන්නුම් කරන ඉලෙක්ට්‍රෝන ඝනත්ව ප්‍රදේශ පෙන්වයි.ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, SPECC1L-kd සෛලවල සම්පූර්ණ අග්‍ර-පාදක සන්ධිය ඉලෙක්ට්‍රෝන ඝනත්වයකින් (J, ඊතල) දිස් වූ අතර, එය වැඩි ඝණත්වය සහ ඇලවුම් හන්දිවල විසිරීම පෙන්නුම් කරයි.(K) β-catenin සංඝටක U2OS සෛල ලයිසේට් වල SPECC1L සමඟ සම-ප්‍රතිශක්තිකරණය කරන ලදී.ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් හතරකින් එකක් නියෝජනය කරන එක් ස්ථානයකින් ලබාගත් පින්තූරය.
Craniofacial morphogenesis හි SPECC1L හි භූමිකාව අවබෝධ කර ගැනීම සඳහා, අපි ස්වාධීන ES උගුල් සෛල රේඛා දෙකක් භාවිතා කරමින් Specc1l ඌන මූසික ආකෘතියක් නිර්මාණය කළෙමු, DTM096 සහ RRH048 (BayGenomics, CA), ඉන්ට්‍රෝන් 1 සහ Specc1l පිටපත් නියෝජනය කරන (රූපය 115 ග්‍රහණය කර ඇත) .4A, රූපය S2).ඩිකොයි දෛශික ඇතුළු කිරීමේ ප්‍රවේණි පිහිටීම සම්පූර්ණ ජෙනෝම අනුක්‍රමණය මගින් තීරණය කරන ලද අතර PCR මගින් තහවුරු කරන ලදී (රූපය S2).ජාන උගුල් සැලසුම් දෙකම Specc11-lacZ වාර්තාකරුවන්ගේ ග්‍රහණයෙන් පසු රාමුව තුළ විලයනය කිරීමට ඉඩ ලබා දුන්නේය.එබැවින්, X-gal staining මගින් නිර්ණය කරන ලද lacZ ප්‍රකාශනය Specc11 ප්‍රකාශනයේ දර්ශකයක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී.ඇලිල දෙකම සමාන lacZ ප්‍රකාශන රටා පෙන්වූ අතර, intron 1 හි DTM096 ජාන උගුල intron 15 හි RRH048 ට වඩා ප්‍රබල ප්‍රකාශනයක් පෙන්නුම් කරයි (නොපෙන්වයි).කෙසේ වෙතත්, E8.5 (රූපය 4B), ස්නායු නාලය සහ E9.5 සහ E10.5 (Figure 4C,D) හි මුහුණේ ක්‍රියාවලීන් (රූපය 4C,D) සහ අත් පා වර්ධනය කිරීමේදී විශේෂයෙන් ප්‍රබල ප්‍රකාශනයක් සහිතව Specc1l පුළුල් ලෙස ප්‍රකාශ වේ. E10 හි.5 සහ ඇස් (රූපය 4D).E10.5 හි පළමු ෆරින්ජියල් ආරුක්කුවේ SPECC1L ප්‍රකාශනය සීඑන්සීසී පෙළපතට අනුකූලව එපිටිලියම් සහ යටින් පවතින මෙසෙන්චයිම් 18 හි පවතින බව අපි කලින් වාර්තා කළෙමු.CNCC හි SPECC1L ප්‍රකාශනය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි E8.5 ස්නායු නැමීම් (රූපය 4E-J) සහ E9.5 හිස් කබල කොටස් (රූපය 4K-) සිදු කළෙමු.E8.5 දී, SPECC1L තීව්‍ර ලෙස වර්ණ ගැන්වූ ස්නායු නැමීම් (පය. 4E, H), NCC සලකුණු සහිත සෛල ඇතුළුව (රූපය 4G, J).E9.5 හිදී, SPECC1L (පය. 4K, N) AP2A (Fig. 4L, M) හෝ SOX10 (Fig. 4O, P) සමඟ සම-පැල්ලම් කරන ලද සංක්‍රමණික CNCC දැඩි ලෙස පැල්ලම් විය.
(A) ES DTM096 (intron 1) සහ RRH048 (intron 15) සෛල ක්ලෝනවල decoy vector ඇතුළු කිරීම පෙන්වන මවුස් Specc11 ජානයේ ක්‍රමානුකූල නිරූපණය.(BD) E8.5 සිට E10.5 දක්වා Specc1l ප්‍රකාශනය නියෝජනය කරන විෂමජාතීය Specc1lDTM096 කළල වල lacZ පැල්ලම් කිරීම.NE = neuroectoderm, NF = ස්නායු ගුණය, PA1 = පළමු ෆරින්ජියල් ආරුක්කුව.(EP) E8.5 (NF; EJ) ස්නායු නැමීම් සහ E9.5 (KP) හිස් කබල කොටස්වල NCC සලකුණු AP2A සහ SOX10 සමඟ SPECC1L ප්රතිශක්තිකරණය.AP2A (F, G; arrowheads) සහ SOX10 (I, J; arrowheads) ලෙස ලේබල් කර ඇති සෛල ඇතුළුව E8.5 (E, H; arrowheads) ස්නායු නැමීම් වල SPECC1L පැල්ලම් බහුලව නිරීක්ෂණය විය.E9.5 දී, SPECC1L AP2A (L, M; ඊතල) සහ SOX10 (O, P; ඊතල) ලෙස ලේබල් කරන ලද සංක්‍රමණික CNCCs (K, N; ඊතල) දැඩි ලෙස පැල්ලම් කර ඇත.
විෂමජාතීය Specc1lDTM096/+ සහ Specc1lRRH048/+ මීයන් අතර හරස් කිරීමෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ ජාන උගුල් ඇලිල දෙක අනුපූරක නොවන බවත් ජාන උගුල් ඇලිලය සඳහා සංයෝග විෂමජාතීය සහ කළල සමජාතීය කළල මාරාන්තික බවත්ය (වගුව S1).මෙන්ඩේලියන් අනුපාත පෙන්නුම් කළේ උපතේදී විෂම සෛලවල පැවැත්මේ අනුපාතය අඩුවීමක් (අපේක්ෂිත 1.34 එදිරිව 2.0).heterozygotes අතර අඩු perinatal mortality අපි සටහන් කළෙමු, සමහරක් හිස්කබලේ විෂමතා ඇති විය (Fig. S3).කෙසේ වෙතත්, මෙම perinatal craniofacial phenotypes වල අඩු විනිවිද යාමක් නිසා ඒවායේ යටින් පවතින ව්‍යාධි භෞතික විද්‍යාත්මක යාන්ත්‍රණ අධ්‍යයනය කිරීම අපහසු වේ.එබැවින්, අපි සමජාතීය Specc11 විකෘතියන්ගේ කලල මාරාන්තික සංසිද්ධිය කෙරෙහි අවධානය යොමු කළෙමු.
බොහෝ සංයෝග විෂමජාතීය හෝ සමජාතීය Specc1lDTM096/RRH048 විකෘති කළල E9.5-10.5 (Fig. 5A-D) ට පසුව වර්ධනය නොවීය, සහ ස්නායුක නළය ඉදිරිපසින් වැසී ගියේ නැත (Fig. 5B, D) සහ සමහර විට පසුපසින් වසා ඇත (පෙන්වන්නේ නැත) ..මෙම හිස්කබල ස්නායු නාල වැසීමේ දෝෂය E10.5 හි ස්නායුක නැමීම්වල ඉතිරිව ඇති CNCC ලෙස සලකුණු කරන ලද DLX2 හි බහුතරය සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති අතර, එය විච්ඡේදනයක් නොමැති බව පෙන්නුම් කරයි (Figure 5A'-D').CNCC හි සමස්ත ප්‍රමාණය ද අඩු වී ඇත්ද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා, අපි Wnt1-Cre සහ ROSAmTmG සමඟ අපගේ ජාන උගුල් රේඛාවල GFP සමඟ CNCC රේඛා ටැග් කළෙමු.අපි සම්පූර්ණ කළල වලින් වර්ග කළ GFP+ NCC සහ GFP- (RFP+) NCC නොවන ප්‍රවාහ කරන්නෙමු.E9.5 හිදී, සාමාන්‍ය CNCC පිරිවිතර පෙන්නුම් කරමින්, ප්‍රවාහ-අනුපිළිවෙළට සකස් කරන ලද GFP-ලේබල් කරන ලද CNCC වල අනුපාතය WT සහ විකෘති කළල (පෙන්වා නැත) අතර සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් නොවීය.එබැවින්, SPECC1L-kd සෛලවල දක්නට ලැබෙන පරිදි, AJ සෛලවල ඝනත්වය වැඩි වීම හෝ විසරණය වීම හේතුවෙන්, දෝෂ සහිත CNCC ස්ථර කිරීම හේතුවෙන් (රූපය 5B') අවශේෂ Wnt1-Cre සහ DLX2 පැල්ලම් ඇති බව අපි උපකල්පනය කළෙමු.අපි NCC මාර්කර් SOX10, AP2A, සහ DLX2 භාවිතා කළේ ස්නායු නැමීමේ CNCC පවතින බව තහවුරු කිරීමට (Figure 5E-R).E8.5 හි, NCC සලකුණු තුන සඳහාම ස්නායු නැමීම් පැල්ලම් WT (Fig. 5E, G, I) සහ Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J) යන කොටස්වල නිරීක්ෂණය කරන ලදී.E9.5 දී, NCC සලකුණු WT කොටස්වල සංක්‍රමණය වන NCC වර්ණ ගැන්වූ අතර (රූපය 5M, O, Q), Specc1l විකෘති කළලවල (Fig. 5N, P, R) නිරාවරණ ස්නායු නැමීම් වල අවශේෂ NCC පැල්ලම් නිරීක්ෂණය විය.SOX10 සහ DLX2 CNCC සංක්‍රමණය වන බැවින්, මෙම ප්‍රතිඵලය යෝජනා කරන්නේ SPECC1L-අඩුපාඩු සහිත CNCCs පශ්චාත් සංක්‍රමණ පිරිවිතර ලබා ගන්නා නමුත් ස්නායුක නැමීම් වලින් සංක්‍රමණය වීමට අපොහොසත් වන බවයි.
Specc11 ඌනතාවය දෝෂ සහිත ස්නායු නල වැසීමට, හිස්කබලේ ස්නායු ලාංඡන සෛල සහ AJs ඉවත් කිරීමට හේතු වේ.
(A, B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre (A') ලෙස ලේබල් කර ඇති සංක්‍රමණික හිස්කබල ස්නායු ලාංඡන සෛල (CNCC) රැගෙන යන කලලරූපය.ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, Specc11 විකෘති කළල විවෘත ස්නායු නැමීම් (B), ඊතල ශීර්ෂ) සහ සංක්‍රමණය නොවූ CNCC (B', arrowheads) පෙන්වයි.(C, D') E10.5 WT කළල (C, C') සහ Specc1l (D, D') හි CNCC මාර්කර් DLX2 හි දීප්තිමත් ක්ෂේත්‍ර රූප (C, D') සහ ප්‍රතිශක්තිකරණ (C', D').WT E10.5 කළල වලදී, DLX2-ධනාත්මක CNCC ගිල් ආරුක්කු (C', ඊතල) යටත් විජිත බවට පත් කරන අතර, විකෘති වලදී, විවෘත ස්නායු නැමීම් (D', ඊතල) සහ පළමු ෆරින්ජියල් ආරුක්කු (D',) තුළ කැපී පෙනෙන පැල්ලම් පවතී. ඊතල).) CNCC හි දුර්වල delamination සහ සංක්‍රමණය පෙන්නුම් කරන සමහර පැල්ලම් (ඊතල) සමඟ.ER) E8.5 (E-L) සහ E9.5 (M-R) අදියරවල WT සහ Specc1l විකෘති කළල කොටස් NCC සලකුණු SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, සමඟ ලේබල් කර ඇත. O, P ) සහ DLX2 (I, J, Q, R).E8.5 හි, NCC පැල්ලම් වල්-වර්ගයේ ස්නායු නැමීම් (NF) සහ විකෘති කොටස් වල නිරීක්ෂණය කරන ලදී.E8.5 WT (K) සහ mutant (L) හි SOX10 සහ β-catenin සම-පැල්ලම් කිරීමෙන් ස්නායුක නැමීම්වල සෛල මායිම්වල β-කැටෙනින් පැල්ලම් වැඩි වී ඇති බව අනාවරණය විය.E9.5 හිදී, සංක්‍රමණික CNCC වල (M, O, Q) වල්-වර්ගයේ පැල්ලම් නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර, විකෘති වලදී, අසංවිධිත CNCC වල විවෘත ස්නායුක නැමීම් (N, P, R) පැල්ලම් විය.(S-Z) E9.5 විකෘතිය සහිත WT සහ Specc11DTM096/RRH048 කළල වල කිරීටක අංශවල vivo AJ ලේබල් කිරීමේ විශ්ලේෂණයේදී.ඉහළ දකුණු කෙළවරේ ආසන්න වශයෙන් කොටස් තලයක් පෙන්වා ඇත.විකෘති පටකවල කොටස්වල, F-actin (S, T) සහ myosin IIb (U, V) වල පැල්ලම් වැඩි වීම නිරීක්ෂණය විය.Fig. 3 හි in vitro ප්රතිඵලවලට සමානව, විකෘති කළලවල, β-catenin (W, X) සහ E-cadherin (Y, Z) සඳහා වැඩිදියුණු කරන ලද පටල පැල්ලම් නිරීක්ෂණය කරන ලදී.(AA-BB) අග්‍ර-පාදක සෛලයේ මායිමෙන් ඔබ්බට පෙනෙන වල්-වර්ගයේ කළල කොටසක ඉලෙක්ට්‍රෝන ක්ෂුද්‍ර ග්‍රැෆ් එකක් ඇලවුම් හන්දි (AA, ඊතල) පෙන්නුම් කරන පැහැදිලි ඉලෙක්ට්‍රෝන ඝන කලාපයක් පෙන්වයි.ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, Specc11 විකෘති කළලවල (BB, ඊතල) කොටස්වල, සමස්ත apicobasal හන්දිය ඉලෙක්ට්‍රෝන ඝනත්වයකින් යුක්ත වන අතර, එය ඇලවුම් සන්ධිවල වැඩි ඝණත්වය සහ විසරණය පෙන්නුම් කරයි.
වෙනස් කරන ලද AJ නිසා ස්ථර කිරීම අඩු වී ඇති බවට අපගේ උපකල්පනය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි Specc1l විකෘති කළලවල නිරාවරණය වූ ස්නායුක නැමීම්වල AJ ලේබල් කිරීම පරීක්ෂා කළෙමු (රූපය 5S-Z).අපි ඇක්ටින් ආතති තන්තු වල වැඩි වීමක් නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 5S, ටී) සහ ඇක්ටින් තන්තු මත මයෝසින් IIB පැල්ලම් කිරීම (රූපය 5U, V) සමගාමීව දේශීයකරණය වැඩි විය.වැදගත් කරුණක් නම්, අන්තර් සෛලීය මායිම්වලදී β-කැටෙනින් (පය. 5W, X) සහ E-කැදරින් (පය. 5Y, Z) වැඩි වීම අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු.අපි E8.5 කළලවල ස්නායු නැමීම් වල NCC හි β-කැටෙනින් පැල්ලම් කිරීම ද පරීක්ෂා කළෙමු (රූපය 5K, L).Specc1l විකෘති ස්නායු නැමීම් (Fig. 5L සහ K) තුළ β-catenin වර්ණ ගැන්වීම වඩාත් ප්‍රබල බව පෙනී ගිය අතර, AJ වෙනස්කම් ආරම්භ වී ඇති බව යෝජනා කරයි.E9.5 කළලවල හිස් කබල කොටස්වල ඉලෙක්ට්‍රෝන මයික්‍රොග්‍රාෆ්වල, WT (පය. 5AA, BB සහ S1E-H) හා සසඳන විට Specc1l විකෘති කළලවල විසරණය වූ ඉලෙක්ට්‍රෝන ඝනත්වය වැඩි වීම අපි නැවතත් නිරීක්ෂණය කළෙමු.එකට ගත් විට, මෙම ප්‍රතිඵල SPECC1L-kd U2OS සෛල තුළ අපගේ in vitro ප්‍රතිඵලවලට සහය වන අතර අපගේ විකෘති කළලවල CNCC ස්තරීකරණයට පෙර අපගමන AJ පැල්ලම් ඇති බව යෝජනා කරයි.
AKT ක්‍රියාකාරකම් සහ E-කැදරින් ස්ථායීතාවය අතර දන්නා ප්‍රතිවිරෝධතා සම්බන්ධය සැලකිල්ලට ගෙන, 17,28 අපි PI3K-AKT සංඥා සම්බන්ධය උපකල්පනය කළෙමු.ඊට අමතරව, E9.5-10.5 හිදී මාරාන්තික තත්ත්වයෙන් (<5%) බේරුණු අපගේ සමහර විකෘති කළලවල උපපීඩර්මල් බිබිලි ඇතිවීම අපි නිරීක්ෂණය කළ අතර ඒ වෙනුවට E13.5 (රූපය S3) හි පදිංචි විය.Subepidermal vesicles යනු PDGFRα12 මත පදනම් වූ PI3K-AKT සංඥාව අඩු කිරීමේ ලක්ෂණයකි.Fantauzzo et al.(2014) වාර්තා කළේ PdgfraPI3K/PI3K විකෘති කළලවල PDGFRα-පාදක PI3K සක්‍රිය කිරීම කඩාකප්පල් කිරීම උප චර්මාභ්‍යන්තර වෙසිලි, ස්නායුක නල දෝෂ සහ ඉරිතැලීම් තාල ෆීනෝටයිප් වලට හේතු වන බවයි.ඇත්ත වශයෙන්ම, pan-AKT සහ සක්‍රීය ෆොස්ෆොරයිලේටඩ් Ser473-AKT මට්ටම් Specc1l විකෘති පටක වල vivo තුළ E9.5 කළල අත් අඩංගුවට ගැනීම දක්වා අඩු කරන ලදී (රූපය 6A-D).පොස්පරීකරණය කරන ලද Ser473-AKT මට්ටම්වල අඩුවීම සම්පූර්ණයෙන්ම vivo (FIG. 6E) සහ in vitro (FIG. 6F) හි pan-AKT මට්ටම්වල අඩුවීම නිසා විය හැක.U2OS සෛල සෛල හැඩයේ සහ AJ ඝනත්වයේ වෙනස්කම් සමඟ දැඩි ලෙස සංකලනය වූ විට පමණක් in vitro අඩුවීමක් නිරීක්ෂණය විය (Figure 6D).මේ අනුව, අපගේ දත්ත යෝජනා කරන්නේ SPECC1L යනු ක්‍රානියෝෆේසියල් මෝෆෝජෙනසිස් හි PI3K-AKT සංඥා වල නව ධනාත්මක නියාමකයෙකු බවයි.
(A-E) E8.5 (A,B) සහ E9.5 (C,D) හිස් කබල කොටස් හෝ E9.5 lysates වෙතින් Specc1l විකෘති කළල (E) සක්‍රීය පොස්පරීකරණය කළ S473-AKT සහ පෑන්-AKT ප්‍රෝටීන් අඩු කිරීමේ මට්ටම් පෙන්වයි. , පාලන WT හා සසඳන විට.වල්-වර්ගයේ ලයිසේට් සහ විකෘති ලයිසේට් මත වෙස්ටර්න් බ්ලොටින් එකම කොන්දේසි යටතේ සිදු කරන ලදී.SPECC1L සඳහා පෙන්වා ඇති පින්තූර එක් බ්ලොට් එකකින් ලබා ගන්නා ලදී.එම පැල්ලම ඉවත් කර ප්‍රති-pan-ACT සහ β-ඇක්ටින් ප්‍රතිදේහ සමඟ නැවත පරීක්ෂා කරන ලදී.E8.5 neural folds (A, B) හි Pan-AKT මට්ටම් සහ E9.5 හිස් කබලේ කොටස්වල පොස්පරීකරණය කරන ලද S473-AKT මට්ටම් සැලකිය යුතු ලෙස අඩු විය.(F) ඉහළ එකමුතුවකදී අස්වනු නෙළන ලද SPECC1L-kd U2OS සෛලවල ලයිසේට් වලදී Pan-AKT මට්ටම් සමානව අඩු කරන ලදී.දෝෂ තීරු ස්වාධීන බටහිර බ්ලොට් ප්‍රමාණ තුනකින් SEM නියෝජනය කරයි.(GJ) සෛල ප්‍රගුණනය (G, G') සහ කුඩා ඇපොප්ටෝටික් ක්‍රියාකාරකම් (H, H') පෙන්නුම් කරමින් පිළිවෙලින් KI67 සහ Cleaved caspase 3 සමග පැල්ලම් කර ඇති E9.5 හි WT කළල කොටස්.Specc11 විකෘති කළල සංසන්දනාත්මක සෛල ප්‍රගුණනය (I) පෙන්නුම් කරයි, නමුත් ඇපොප්ටෝසිස් වලට භාජනය වන සෛල සංඛ්‍යාව සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි වේ (J).
පසුව අපි ප්‍රගුණනය සහ ඇපොප්ටෝසිස් සලකුණු පරීක්ෂා කළෙමු.KI67 staining මගින් මනිනු ලබන WT mutants සඳහා 82.5% සහ Specc1l mutants සඳහා 86.5% (p <0.56, Fisher's) ප්‍රගුණන දර්ශකයක් සමඟින් E9.5 කළල පැතිරීමේ (රූපය 6E, G I හා සසඳන විට) කිසිදු වෙනසක් අපි නිරීක්ෂණය නොකළෙමු. නිශ්චිත පරීක්ෂණය).ඒ හා සමානව, කළල අත් අඩංගුවට ගන්නා තෙක් (නොපෙන්වන) (පෙන්වන්නේ නැත) E8.5 හි ස්නායුක නැමීම්වල ඇති කැස්පේස් 3 සඳහා පැල්ලම් කිරීමෙන් මනිනු ලබන ඇපොප්ටෝසිස් වල වෙනසක් අපි නිරීක්ෂණය නොකළෙමු.ඊට වෙනස්ව, සියලුම E9.5 විකෘති කළලවල ඇපොප්ටෝසිස් සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය (රූපය 6F, H සහ J).ඇපොප්ටෝසිස් හි මෙම සමස්ත වැඩිවීම අඩු වූ PI3K-AKT සංඥා සහ මුල් කලල මාරක 29,30,31 සමඟ අනුකූල වේ.
මීළඟට, අපගේ kd සෛලවල AJ වෙනස්කම් වලදී PI3K-AKT සංඥා සඳහා හේතුකාරක භූමිකාවක් තහවුරු කිරීම සඳහා, අපි පාලනයේ සහ kd සෛලවල මාර්ගය රසායනිකව වෙනස් කළෙමු (රූපය 7A-F).අපි සංගම SPECC1L-kd සෛලවල නිරීක්ෂණය කරන ලද සෛල හැඩය වෙනස් කිරීමේ සංසිද්ධිය සලකුණක් ලෙස භාවිතා කළ අතර, අපි දිගම මානය (දිග) අනුරූප සිරස් මානයට (පළල) අනුපාතය භාවිතා කර ගණනය කළෙමු.සාපේක්ෂව වටකුරු හෝ ඝනක සෛල සඳහා 1 අනුපාතයක් අපේක්ෂා කෙරේ (රූපය 7G).සෛල හැඩයට අමතරව, අපි β-catenin staining (Fig. 7A'-F') මගින් AJ මත බලපෑම තහවුරු කළෙමු.wortmannin භාවිතා කරමින් PI3K-AKT මාර්ගය නිෂේධනය කිරීම පාලන සෛලවල සෛල හැඩය වෙනස් කිරීමට ප්‍රමාණවත් විය (රූපය 7A,C) සහ AJ (රූපය 7A').PI3K-AKT සක්‍රියකාරක SC-79 පාලන සෛල තුළ සෛල හැඩයට (FIG. 7A, E) හෝ AJ ප්‍රසාරණයට (FIG. 7A') බල නොපායි.SPECC1L-kd සෛල තුළ, PI3K-AKT මාර්ගය තවදුරටත් යටපත් කිරීම නිසා apoptosis වැඩි වීම (Fig. 7B,D) සහ β-catenin staining හි කැපී පෙනෙන වැඩි වීමක් (Fig. 7B'), අපගේ in vivo බර විකෘති වලට අනුකූල වේ.වැදගත් ලෙස, PI3K-AKT මාර්ගය සක්‍රිය කිරීම සෛල හැඩය (රූපය 7B,F) සහ AJ ෆීනෝටයිප් (Figure 7B") සැලකිය යුතු ලෙස වැඩිදියුණු විය.සෛල හැඩයේ වෙනස්කම් සෛල වටකුරු අනුපාතය (CCR) ලෙස ප්‍රමාණ කරන ලද අතර ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි වැදගත්කම සඳහා සංසන්දනය කරන ලදී (FIG. 7G).ඇත්ත වශයෙන්ම, පාලන සෛල තුළ (පය. 7G, CCR = 1.56), wortmannin ප්රතිකාරය සෛල හැඩය සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් කිරීමට ප්රමාණවත් විය (රූපය 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) නිරීක්ෂණය කරන ලද ප්රමාණයට සමාන වේ. SPECC1L හි.-kd සෛල (රූපය 7G, CCR = 3.46).SPECC1L-kd සෛලවල Wortmannin ප්‍රතිකාරය (රූපය 7G, CCR = 3.60, නොසැලකිය හැකි) ප්‍රතිකාර නොකළ kd සෛල (රූපය 7G, CCR = 3.46, නොසැලකිය හැකි) හෝ wortmannin-ප්‍රතිකාර කළ පාලන සෛල (රූපය 7G) වඩා වැදගත් නොවේ., CCR = 3.46, නොසැලකිය හැකි) අතිරේකව සෛල දිගු කිරීම (7G, CCR = 3.61, නොසැලකිය හැකි) බලපායි.වඩාත්ම වැදගත් දෙය නම්, SC-79 AKT සක්‍රියකාරකය SPECC1L-kd සෛලවල දිගටි ෆීනෝටයිප් ප්‍රතිෂ්ඨාපනය කරන ලදී (රූපය 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).මෙම ප්‍රතිඵල මගින් SPECC1L PI3K-AKT සංඥා නියාමනය කරන බව තහවුරු කරන අතර SPECC1L හි මධ්‍යස්ථ අඩුවීමක් සෛල ඇලීමට බලපාන අතර ප්‍රබල අඩුවීමක් ඇපොප්ටෝසිස් වලට මග පාදයි (රූපය 8).
(A-F') පාලන (A, C, E) සහ SPECC1L-kd (B, D, F) සෛල PI3K-AKT මාර්ග නිෂේධක wortmannin (C, D) හෝ SC-79 සක්‍රියකාරක (E, F) ප්‍රතිකාරය සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීම .ප්‍රතිකාර නොකළ පාලන සෛල cuboidal (A) සාමාන්‍ය β-cat cellular staining (A') වන අතර kd සෛල දිගටි (B) β-cat staining (B') වැඩි වේ.PI3K-AKT මාර්ගය මර්දනය කිරීමෙන් පසුව, β-cat ප්‍රසාරණය (C') සමඟ දිගටි (C) සෛල පාලනය කරන අතර, kd සෛල අපගේ අතිශයින් විකෘති කළ කළලවලට සමාන හා අතිශයින් වැඩි දියුණු කළ β-cat පෙන්නුම් කරන ඇපොප්ටෝසිස් (D) වලට භාජනය වීමට පටන් ගත්තේය.පැල්ලම් කිරීම (D').PI3K-AKT මාර්ගය සක්‍රිය කිරීමෙන් පසුව, පාලන සෛල cuboidal (E) පැවති අතර සාමාන්‍ය β-cat (E') පැල්ලම් ඇති අතර, kd සෛල සැලකිය යුතු ලෙස වැඩිදියුණු කළ සෛල හැඩය (F) සහ β-cat (F') පැල්ලම් පෙන්නුම් කරයි. (G) MetaMorph මෘදුකාංගය භාවිතයෙන් (AF) සෛල හැඩය වෙනස් වීමේ ප්‍රමාණය දීර්ඝතම මානයෙහි (දිග) සහ ඊට අනුරූප සිරස් මානයෙහි (පළල) සෛල වටකුරු අනුපාතය (CCR) භාවිතයෙන් ප්‍රමාණ කරන ලදී.ප්‍රතිකාර නොකළ (NT) SPECC1L-kd සෛල (CCR = 3.46) පාලන සෛල වලට වඩා සැලකිය යුතු තරම් දිගු විය (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).පාලන සෛල තුළ PI3K-AKT මාර්ගයෙහි වෝර්ට්ගේ නිෂේධනය සෛල හැඩයේ සමාන දිගුවක් ඇති කිරීමට ප්‍රමාණවත් විය (CCR=3.61, p<2.4×10-9).ඒ හා සමානව, SPECC1L-kd සෛල තුළ SC-79 විසින් AKT සක්‍රීය කිරීම මඟින් සෛල දිගුව පාලන මට්ටම් වෙත ප්‍රතිෂ්ඨාපනය කරන ලදී (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).SPECC1L-kd සෛල වල Wortmannin ප්‍රතිකාරය apoptosis වැඩි කිරීමට හේතු වූ නමුත් ප්‍රතිකාර නොකළ kd (CCR=3.46, ns) හෝ wortmannin-ප්‍රතිකාර කළ පාලන සෛල (3.61) සමඟ සසඳන විට සෛල හැඩයේ වෙනසක් (CCR=3.60) තවදුරටත් වැඩි නොවේ.ns = කමක් නැහැ.+/- සෛල 50 ක් සඳහා SEM මිනුම් පෙන්වා ඇත.ශිෂ්‍ය ටී-පරීක්‍ෂණය භාවිතයෙන් සංඛ්‍යානමය වෙනස්කම් ගණනය කරන ලදී.
(A) PI3K-AKT මාර්ගය නිෂේධනය කිරීම සහ සක්‍රීය කිරීම ක්‍රමානුකූලව නිරූපණය කිරීම, පිළිවෙලින් AJ වෙනස්කම් සහ ගලවා ගැනීම සිදු කරයි.(B) SPECC1L මගින් AKT ප්‍රෝටීන් ස්ථායීකරණය සඳහා යෝජිත ආකෘතිය.
Premigratory CNCCs සඳහා AJ lysis අවශ්‍ය වන්නේ පූර්ව ස්නායු නැමීම් neuroepithelial සෛල 1,15,32 වලින් වෙන් කිරීමයි.AJ සංරචකවල පැල්ලම් වැඩි වීම සහ SPECC1L හි ඌනතාවයෙන් යුත් සෛලවල සහ vivo තුළ ඇති අග්‍ර-පාදක AJ අසමමිතික ව්‍යාප්තිය නැතිවීම, SPECC1L β-catenin වෙත භෞතික සමීපත්වය සමඟ ඒකාබද්ධව, AJ දේශීය ස්ථායිතාව නිසි ලෙස පවත්වා ගැනීමට SPECC1L ක්‍රියා කරන බව යෝජනා කරයි. සංවිධානයේ මාංශ පේශි.Actin cytoskeleton.ඇක්ටින් සයිටොස්කෙලිටන් සහ β-කැටෙනින් සමඟ SPECC1L සම්බන්ධ වීම සහ SPECC1L නොමැති විට ඝනීභවනය වූ ඇක්ටින් සූතිකා ගණන වැඩි වීම AJ ඝනත්වයේ නිරීක්ෂණය කරන ලද වැඩි වීම සමග අනුකූල වේ.තවත් හැකියාවක් නම්, SPECC1L-අඩුපාඩු සහිත සෛලවල ඇක්ටින් තන්තු ප්‍රමාණය වැඩි වීම අන්තර් සෛලීය ආතතියේ වෙනසක් ඇති කරයි.සෛලීය ආතතිය AJ 33 ගතිකයට බලපාන බැවින්, වෝල්ටීයතා වෙනස්වීම් AJ 34 වඩාත් විසරණය වීමට හේතු විය හැක.එබැවින් ඕනෑම වෙනස්කමක් CNCC ස්ථරවලට බලපානු ඇත.
Wnt1 ස්නායු ලාංඡන සෛල ඇති කරන මුල් ස්නායු නැමීම් වලින් ප්‍රකාශ වේ.මේ අනුව, Wnt1-cre පෙළපත ලුහුබැඳීම NCC35 පෙර සහ සංක්‍රමණය යන දෙකම සලකුණු කරයි.කෙසේ වෙතත්, Wnt1 ද මුල් ස්නායු නැමීම් 35,36 වෙතින් ව්‍යුත්පන්න වූ පෘෂ්ඨීය මොළයේ පටක ක්ලෝන සලකුණු කරයි, එමඟින් විවෘත ස්නායුක නැමීම්වල Wnt1 සලකුණු සඳහා අපගේ E9.5 විකෘති පැල්ලම් කිරීම CNCC නොවේ.NCC සලකුණු AP2A සහ SOX10 සඳහා අපගේ ධනාත්මක පැල්ලම් මගින් Specc11 විකෘති කළලවල නිරාවරණය වූ ස්නායු නැමීම් ඇත්ත වශයෙන්ම CNCC අඩංගු බව තහවුරු විය.මීට අමතරව, AP2A සහ SOX10 කලින් සංක්‍රමණය වන NCC සලකුණු කරන බැවින්, ධනාත්මක පැල්ලම් පෙන්නුම් කළේ මෙම සෛල E9.5 මගින් ස්ථරීකරණය කළ නොහැකි පශ්චාත් සංක්‍රමණ CNCC බවයි.
SPECC1L මගින් AJ හි අණුක නියාමනය PI3K-AKT සංඥා මගින් මැදිහත් වන බව අපගේ දත්ත යෝජනා කරයි.SPECC1L ඌනතාවයෙන් යුත් සෛල සහ පටක වල AKT සංඥාව අඩු වේ.Fantauzzo et al විසින් සොයා ගැනීම්.PI3K-AKT සංඥා සඳහා සෘජු භූමිකාවක් සඳහා සහය දක්වන්න.(2014) පෙන්නුම් කළේ PDGFRα-පාදක PI3K-AKT සංඥා සක්‍රිය නොවීම හේතුවෙන් පැලී ෆීනෝටයිප් ඇති වන බවයි.U2OS සෛල තුළ AJ සහ සෛල හැඩය වෙනස් කිරීමට PI3K-AKT මාර්ගය නිෂේධනය කිරීම ප්‍රමාණවත් බව ද අපි පෙන්වමු.අපගේ සොයාගැනීම් වලට අනුකූලව, Cain et al.37 පෙන්නුම් කළේ එන්ඩොතලියල් සෛලවල PI3K α110 අනු ඒකකය පහත හෙලීමෙන් "සම්බන්ධතා දර්ශකයේ" වැඩි වීමක් ලෙස හැඳින්වෙන පරිසෙලියුලර් β-කැටෙනින් පැල්ලම් වල සමාන වැඩි වීමක් ඇති වන බවයි.කෙසේ වෙතත්, ඇක්ටින් සූතිකා දැනටමත් ඉතා සංවිධිත වී ඇති එන්ඩොතලියල් සෛල තුළ, PI3K-AKT මාර්ගය මර්දනය කිරීම ලිහිල් සෛල හැඩයක් ඇති කරයි.ඊට වෙනස්ව, SPECC1L-kd U2OS සෛල දිගටි සෛල හැඩයක් පෙන්නුම් කළේය.මෙම වෙනස සෛල වර්ගය විශේෂිත විය හැකිය.PI3K-AKT සංඥාව මර්දනය කිරීම ඇක්ටින් සයිටොස්කෙලිටනයට ස්ථිරවම බලපාන අතර, සෛල හැඩය මත බලපෑම තීරණය වන්නේ මධ්යම ඇක්ටින් තන්තු වල ඝනත්වය සහ සංවිධානයේ වෙනස්කම් හේතුවෙන් ඇතිවන ආතතිය වෙනස් වීමෙනි.U2OS සෛල තුළ, අපි SPECC1L-අඩුපාඩු AJ වෙනස් කිරීම සහ ප්‍රතිසාධනය සලකුණු කිරීමක් ලෙස භාවිතා කළේ සෛල හැඩ වෙනස් කිරීම් පමණි.අවසාන වශයෙන්, අපි උපකල්පනය කරන්නේ SPECC1L ඌනතාවයේ AKT මාර්ගය නිෂේධනය කිරීම AJ ස්ථායිතාව වැඩි කරන අතර CNCC හි delamination අඩු කරයි.
AKT ප්‍රෝටීන් ස්ථායීතාවයේ හෝ පිරිවැටුමේ මට්ටමින් PI3K-AKT සංඥා නියාමනය කිරීම යෝජනා කරමින් SPECC1L නොමැති විට ෆොස්ෆොරයිලේටඩ් 473-AKT මට්ටම්වලට අමතරව vitro සහ in vivo තුළ Pan-AKT මට්ටම් අඩු කිරීම සිත්ගන්නා කරුණකි.Opitz/GBBB සින්ඩ්‍රෝමය හා සම්බන්ධ SPECC1L සහ MID1 ජාන, ක්ෂුද්‍ර නල 18,22 ස්ථාවර කරන ප්‍රෝටීන සංකේතනය කරයි.SPECC1L සහ MID1 ක්ෂුද්‍ර නල ස්ථායීකරණයට මැදිහත් වන යාන්ත්‍රණය සම්පූර්ණයෙන් වටහාගෙන නොමැත.SPECC1L සම්බන්ධයෙන් ගත් කල, මෙම ස්ථායීකරණයට ක්ෂුද්‍ර නල 18 හි උප කුලකයක වැඩි දියුණු කළ ඇසිටිලේෂන් ඇතුළත් වේ.AKT වැනි අනෙකුත් ප්‍රෝටීන ස්ථායී කිරීමට SPECC1L සමාන යාන්ත්‍රණයක් භාවිතා කරයි.AKT ප්‍රෝටීනයේ ඇති ලයිසීන් අපද්‍රව්‍ය ඇසිටයිලේෂන් පටල ප්‍රාදේශීයකරණය සහ පොස්පරීකරණය අඩුවීමට හේතු වන බව පෙන්වා දී ඇත.මීට අමතරව, AKT මත එකම ලයිසීන් අවශේෂයේ K63 දාමය සර්වප්‍රකාර කිරීම එහි පටල ප්‍රාදේශීයකරණය සහ සක්‍රීය කිරීම සඳහා අවශ්‍ය වේ39,40.විවිධ ඉහළ ප්‍රතිදාන යීස්ට් ද්වි-දෙමුහුන් තිරවල හඳුනාගෙන ඇති SPECC1L ප්‍රෝටීන සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන සාධක කිහිපයක් අතර, හතරක් - CCDC841, ECM2942, APC සහ UBE2I43 - සර්වබලධාරී හෝ සුමොයිලේෂන් හරහා ප්‍රෝටීන් පිරිවැටුම හෝ ස්ථායීතාවයට සම්බන්ධ වී ඇත.SPECC1L AKT ස්ථායීතාවයට බලපාන AKT ලයිසීන් අවශේෂවල පශ්චාත් පරිවර්තන වෙනස් කිරීම්වලට සම්බන්ධ විය හැක.කෙසේ වෙතත්, AKT ප්‍රෝටීනයේ ප්‍රාදේශීයකරණය සහ ස්ථායීතාවය සඳහා SPECC1L හි තීරණාත්මක කාර්යභාරය තවමත් පැහැදිලි කළ යුතුය.
vivo හි SPECC1L ප්‍රකාශනයේ ඇති දැඩි දෝෂ හේතුවෙන් AJ මාකර් පැල්ලම් සහ දෝෂ සහිත CNCC ආවරණය වැඩි වීම මෙන්ම ඇපොප්ටෝසිස් සහ මුල් කලල මාරාන්තික වීම වැඩි විය.පෙර වාර්තා පෙන්වා දී ඇත්තේ ඇපොප්ටෝසිස් මට්ටම් වැඩි වූ මූසික විකෘති ස්නායු නල දෝෂ 44,45,46,47 සහ හිස් කබලේ දෝෂ සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති බවයි.ස්නායුක නැමීම් හෝ ෆරින්ජියල් ආරුක්කු වල අධික ලෙස සෛල මිය යාම නිසා නිසි රූපජනක චලනය සඳහා අවශ්‍ය සෛල ප්‍රමාණවත් නොවීම 48,49,50 විය හැකි බව යෝජනා කර ඇත.ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, මධ්‍යස්ථව අඩු කරන ලද SPECC1L ප්‍රකාශනය සහිත අපගේ SPECC1L ඌන සෛල රේඛා පෙන්නුම් කළේ සෛල මිය යාමේ සාක්ෂි නොමැතිව AJ වෙනස්කම් පමණි.කෙසේ වෙතත්, මෙම Kd සෛල තුළ PI3K-AKT මාර්ගයෙහි රසායනික නිෂේධනය හේතුවෙන් ඇපොප්ටෝසිස් වැඩි විය.මේ අනුව, SPECC1L ප්‍රකාශනයේ හෝ ශ්‍රිතයේ මධ්‍යස්ථ අඩුවීමක් සෛල පැවැත්ම සහතික කරයි.මෙය st.E9.5—සමහරවිට අඩු වූ ජාන ග්‍රහණය කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාවය හේතුවෙන්—ඔවුන්ගේ ස්නායු නාල වසා දැමීමටත් පසුව සංවර්ධනයේදී නතර කිරීමටත් හැකි වේ, බොහෝ විට හිස්කබලේ දෝෂ සහිතව (Fig. S3).මෙයට අනුකූල වන්නේ හිස් කබලේ අසාමාන්‍යතා සහිත විෂමජාතීය Specc1l කළල දුර්ලභ සිදුවීම - බොහෝ විට ජාන ග්‍රහණය කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව වැඩි වීම නිසා - මෙන්ම SPECC1L orthologues (specc1lb) දෙකෙන් එකක් (specc1lb) ප්‍රමාද කළල අහිමි වීම ඇතුළුව zebrafish හි සොයා ගැනීමයි. පහළ හකු සහ ද්විපාර්ශ්වික ඉරිතැලීම්51.මේ අනුව, මානව රෝගීන් තුළ හඳුනාගෙන ඇති විෂමජාතීය SPECC1L ක්‍රියාකාරීත්වය නැති වී යාමේ විකෘති, හිස්කබලේ morphogenesis තුළ SPECC1L ක්‍රියාකාරීත්වයේ කුඩා දුර්වලතා ඇති කළ හැකි අතර, එය ඔවුන්ගේ ඔෙරෆේසියල් ඉරිතැලීම් පැහැදිලි කිරීමට ප්‍රමාණවත් වේ.SPECC1L මත පදනම් වූ අන්තර් සෛලීය සම්බන්ධතා නියාමනය, ෆරින්ජියල් ආරුක්කු වල පැලටෝජෙනසිස් සහ විලයනය සඳහා භූමිකාවක් ඉටු කරයි.SPECC1L ක්‍රියාකාරීත්වය පිළිබඳ වැඩිදුර අධ්‍යයනයන් මගින් ස්නායු පීතලීය සෛල චලිතය සහ ක්‍රානියෝෆේසියල් මෝර්ෆොජෙනසිස් තුළ ස්නායු නාල වැසීමේදී CNCC හි තාවකාලික අන්තර් සෛල සම්බන්ධතා වල භූමිකාව පැහැදිලි කිරීමට උපකාරී වේ.
U2OS ඔස්ටියෝසාර්කෝමා පාලනය සහ SPECC1L-kd සෛල කලින් විස්තර කර ඇත (Saadi et al., 2011).SPECC1L වලට එරෙහි ප්‍රතිදේහ මීට පෙරද සංලක්ෂිත කර ඇත (Saadi et al., 2011).Anti-catenin ප්‍රතිදේහ (හාවා; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (මූසිකය; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-caderin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , කැලිෆෝනියාව), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, MA, Waltham ) , KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), cleaved caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) සහ β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis MO ) විස්තර කර ඇති පරිදි භාවිතා කරන ලදී..ඇක්ටින් සූතිකා Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado) සමඟ පැල්ලම් කර ඇත.
U2OS පාලන සෛල සහ SPECC1L-kd සෛල සම්මත ඉහළ ග්ලූකෝස් DMEM හි 10% භ්‍රෑණ ගව මස්තු (Life Technologies, Carlsbad, CA) සමඟ පරිපූරණය කරන ලදී.AJ වෙනස්කම් සඳහා, 2 x 105 සෛල 0.1% porcine ජෙලටින් (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) සමඟ ප්රතිකාර කරන ලද වීදුරු මත බීජ කරන ලද අතර සෛල හැඩයේ වෙනස්කම් සඳහා නිරීක්ෂණය කරන ලදී.විවිධ දක්වා ඇති කාල වකවානුවලදී සෛල එකතු කරන ලදී: බීජ වැපිරීමෙන් පැය 4 කට පසු (t = 1), බීජ වැපිරීමෙන් පැය 24 කට පසු (t = 2), සෛල හැඩයේ වෙනසක් නොමැතිව එකතු වීම (t = 3), සෛල හැඩය වෙනස් කිරීම (t = 4) , සෛල හැඩය වෙනස් වීමෙන් පසු පැය 24 (t = 5) සහ සෛල හැඩය වෙනස් වීමෙන් පසු පැය 48 (t = 6) (රූපය 1, 2, 3).PI3K-AKT මාර්ගය මොඩියුලේට් කිරීම සඳහා, PI3K-AKT inhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) හෝ SC-79 සක්‍රියකාරකය (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams) සමඟින් දක්වා ඇති සාන්ද්‍රණයන්හි සෛල වගා කරන ලදී.රසායනික ද්රව්ය අඩංගු මාධ්යය දිනපතා වෙනස් කරන ලදී.
සාමාන්‍ය සංස්කෘතික තත්ව යටතේ සජීවී පාලනය සහ KD සෛල මත රාමු-රාමු පටිගත කිරීම් සිදු කරන ලද අතර, අදියර ප්‍රතිවිරෝධතා රූප දින 7ක් සඳහා සෑම විනාඩි 10කට වරක් එකතු කරන ලදී.යාන්ත්‍රික වේදිකාවකින් සහ QImaging Retiga-SRV කැමරාවකට සම්බන්ධ 10 × N-PLAN අරමුණකින් සමන්විත පරිගණක පාලිත Leica DM IRB ප්‍රතිලෝම අන්වීක්ෂයක් භාවිතයෙන් පින්තූර ලබා ගන්නා ලදී.රූපගත කිරීමේදී, සෛල සංස්කෘතීන් 5% CO2 සහිත තෙතමනය සහිත වායුගෝලය තුළ 37 ° C දී පවත්වා ගෙන යනු ලැබේ.
Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) වෙතින් DTM096 සහ RRH048 යන ජාන උගුල් ES සෛල රේඛා දෙකක් Specc11 ඌන මූසික රේඛා ජනනය කිරීම සඳහා Specc1lgtDTM096 සහ Specc1lgtRRH046 ලෙස නම් කරන ලදී.කෙටියෙන්, 129/REJ ES සෛල C57BL6 බ්ලාස්ටොසිස්ට් වලට එන්නත් කරන ලදී.එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස chimeric පිරිමි මීයන් ගැහැණු C57BL6 මීයන් සමඟ අභිජනනය කරන ලද්දේ agouti coat coloration සහිත දරුවන් හඳුනාගැනීම සඳහාය.ජාන උගුල් දෛශික ඇතුළත් කිරීම් තිබීම විෂමජාතීය හඳුනා ගැනීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී.මීයන් 129/REJ;C57BL6 මිශ්‍ර පසුබිමක තබා ඇත.ප්‍රවේණි උගුල් දෛශිකය ඇතුළත් කිරීමේ ස්ථානයේ පිහිටීම RT-PCR, ජාන අනුක්‍රමණය සහ ජානමය අනුපූරකය මගින් තහවුරු කරන ලදී (පරිපූරක රූපය 1).ද්විත්ව විෂමජාතීය Specc1lGT මීයන්ගේ CNCC පරම්පරාව සොයා ගැනීම සඳහා ROSAmTmG (#007576) සහ Wnt1-Cre (#003829) මීයන් (Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME) හරහා ROSAmTmG සහ Wnt1-Cre all Speccre සියලු Speccre නිපදවන ලදී.කැන්සාස් විශ්ව විද්‍යාලයේ වෛද්‍ය මධ්‍යස්ථානයේ ආයතනික සත්ව ආරක්ෂණ සහ භාවිත කමිටුව විසින් අනුමත කරන ලද ප්‍රොටෝකෝල අනුව මීයන් පිළිබඳ සියලුම පරීක්ෂණ සිදු කරන ලදී.
කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 60 ක් සඳහා කළල (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) තුළ සවි කර ඇත.X-gal පැල්ලම් ද්‍රාවණයේ සවි කිරීමෙන් පසු (5 mM පොටෑසියම් ෆෙරිසියනයිඩ්, 5 mM පොටෑසියම් ෆෙරෝසයනයිඩ්, 2 mM MgCl2, 0.01% සෝඩියම් ඩිඔක්සිකොලේට්, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) 37 ° C දී පැල්ලම් වර්ධනය සිදු කරන ලදී. .පැය 1-6 ක් ඇතුළත ° C.කළල 4% PFA හි පසු සවි කර දෘශ්‍යකරණය කරන ලදී.
Western blotting සඳහා, HALT ප්‍රෝටීස් නිෂේධක (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) මිශ්‍රණයකින් පරිපූරණය කරන ලද passive lysis buffer (Promega, Fitchburg, WI) තුළ සෛල ලයිස් කරන ලදී.ලයිසේට් 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX සූදානම් කළ ජෙල් (Bio-Rad, Hercules, CA) මත සකසන ලද අතර Immobilon PVDF පටල (EMD Millipore, Billerica, MA) වෙත මාරු කරන ලදී.0.1% Tween අඩංගු PBS හි 5% කිරි වල පටල අවහිර කර ඇත.ප්‍රතිදේහ එක රැයකින් 4°C දී හෝ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැයක් පුරවා ඇත.Femto SuperSignal West ECL ප්‍රතික්‍රියාකාරකය (Thermo Scientific, Waltham, MA) සංඥා උත්පාදනය සඳහා භාවිතා කරන ලදී.ප්‍රතිශක්තිකරණය සඳහා, කළල 4% PFA/PBS වලින් එක රැයකින් සවි කර ක්‍රියෝප්‍රෙසර්ව් කරන ලදී.1% සාමාන්‍ය එළු සෙරුමය (Thermo Scientific, Waltham, MA) සහ 0.1% ට්‍රයිටන් X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) අඩංගු PBS හි පටක ක්‍රියෝසෙක්ෂන් අවහිර කර පසුව ඉන්කියුබේටරයක 4°C දී ඉන්කියුබේටරය කරන ලදී. රෑ.ප්රති-ප්රතිදේහ සහ ප්රතිදීප්ත ද්විතියික ප්රතිදේහ (1: 1000) සමඟ 4 ° C දී පැය 1 ක්.පැල්ලම් සහිත කොටස් ProLong රන් මාධ්‍යයේ (Thermo Scientific, Waltham MA) තැන්පත් කර ඇති අතර Leica TCS SPE confocal අන්වීක්ෂයක් භාවිතයෙන් පැතලි රූප ලබා ගන්නා ලදී.සෑම ප්රතිශක්තිකරණයක්ම අවම වශයෙන් විකෘති කළල දෙකක cirossections මත ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් තුනක් ලෙස සිදු කරන ලදී.නියෝජිත අත්හදා බැලීමක් පෙන්වා ඇත.
සෛල නවීකරණය කරන ලද RIPA බෆරය (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, සහ HALT protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis) තුළ පුර්වගත කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, ලයිසේට් ප්‍රෝටීන් G චුම්බක පබළු (ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්, කාල්ස්බෑඩ්, සීඒ) සමඟ පූර්ව පිරිසිදු කර, පසුව 4 ° C දී එක රැයකින් පුර්වීකරණය කරන ලදී. SPECC1L විරෝධී හෝ IgG ප්‍රෝටීන් G ප්‍රෝටීන් පබළු සමඟ SPECC1L නිස්සාරණය කිරීම සඳහා භාවිතා කරන ලද අතර ප්‍රතිරෝධය භාවිතයෙන් බටහිර බ්ලොටිං සිදු කරන ලදී. ඉහත විස්තර කර ඇති -β-catenin ප්‍රතිදේහ පෙන්වා ඇති co-IP අත්හදා බැලීම් ස්වාධීන පරීක්ෂණ හතරක් නියෝජනය කරයි.
කැන්සාස් විශ්ව විද්‍යාලයේ වෛද්‍ය මධ්‍යස්ථානයේ ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂ මධ්‍යස්ථානය වෙත ස්ථාවර සංස්කෘතික සෛල හෝ මූසික කළල පටක ලබා දෙන ලදී.කෙටියෙන් කිවහොත්, සාම්පල EMbed 812 දුම්මල (ඉලෙක්ට්‍රෝන මයික්‍රොස්කොපි සයන්සස්, වොෂිංටන්, පීඒ කොටුව) තුළ තැන්පත් කරන ලදී, 60 ° C දී එක රැයකින් බහුඅවයවීකරණය කරන ලද අතර දියමන්ති තලයකින් සමන්විත Leica UC7 ultramicrotome භාවිතා කරමින් 80 nm ට කොටස් කරන ලදී.100 kV Lab6 තුවක්කුවකින් සමන්විත JEOL JEM-1400 සම්ප්‍රේෂණ ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂයක් භාවිතයෙන් කොටස් දෘශ්‍යමාන කරන ලදී.
මෙම ලිපිය උපුටා දක්වන්නේ කෙසේද: Wilson, NR et al.SPECC1L හි ඌනතාවය විභේදනය වූ සන්ධිවල ස්ථායීතාවය වැඩි කිරීමට සහ හිස්කබලේ ස්නායු ලාංඡන සෛලවල විජලනය අඩු කිරීමට හේතු වේ.විද්යාව.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
ශාන්ත-ජීන්, ජේ.-පී.ස්නායු ලාංඡනයේ ප්‍රේරණය සහ අවකලනය.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
කෝඩෙරෝ, ඩීආර් සහ අල්.චලනය වන හිස්කබල ස්නායු ලාංඡන සෛල: හිස් කබලේ වර්ධනයේ ඔවුන්ගේ භූමිකාව.වෛද්‍ය ජාන විද්‍යාව පිළිබඳ ඇමරිකානු සඟරාව.A කොටස 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: වසර 20 ක් පුරා එහි වර්ධනය හා සංවර්ධනය.ළමා රෝග විශේෂඥයා.ව්යාධිවේදය.රසායනාගාරය.ඖෂධය.17, 1–25 (1997).
මැන්ගෝල්ඩ් ඊ., ලුඩ්විග් කේයූ සහ නොටෙන් එම්එම් ඔරොෆියල් ඉරිතැලීම් වල ජාන විද්‍යාවේ ඉදිරි ගමන.අණුක වෛද්‍ය විද්‍යාවේ ප්‍රවණතා 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
මිනු, එම්. සහ රිලී, හිස් කබලේ ස්නායු ලාංඡන සෛල සංක්‍රමණයේ සහ ක්‍රානියෝෆේසියල් වර්ධනයේදී රටා සැකසීමේ එෆ්එම් අණුක යාන්ත්‍රණ.සංවර්ධන 137, 2605-2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH සහ Murray, JK Cleft lip and palate: ජානමය සහ පාරිසරික බලපෑම් අවබෝධ කර ගැනීම.ස්වභාවික අදහස්.ජාන 12, 167-178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
ඉන්ග්‍රම්, සීආර් සහ අල්.ඉන්ටර්ෆෙරෝන්-නියාමනය කිරීමේ සාධකය-6 (Irf6) හි සම, අත් පා සහ හිස් කබලේ ප්‍රදේශයේ අසාමාන්‍ය රූපජනකකරණය - ඌන මීයන්.ජාතික ජෙනට්.38, 1335-1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.GRHL3 හි ප්‍රමුඛ විකෘති කිරීම් වැන් ඩර් වෝඩ් සින්ඩ්‍රෝමය ඇති කරන අතර මුඛ පර්යන්තයේ වර්ධනය අඩාල කරයි.Am J Hum Genet 94, 23-32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ සහ Juriloff, DM ස්නායු නල වැසීමේ දෝෂ සහිත මූසික විකෘති ලැයිස්තුව යාවත්කාලීන කර ස්නායු නල වැසීම පිළිබඳ සම්පූර්ණ ජානමය අවබෝධයක් කරා ගමන් කරයි.උපත් ආබාධ පිළිබඳ විමර්ශනය.A කොටස, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-මැදිහත් PDGFRalpha සංඥා කිරීම p53 මත යැපෙන අන්තර් සෛලීය මාර්ගයක් හරහා අස්ථි වර්ධනයේ පැවැත්ම සහ ප්‍රගුණනය නියාමනය කරයි.ජාන සංවර්ධනය 28, 1005-1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND සහ Murdoch, JN Disheveled: ස්නායු නාල වැසීමට අභිසාරී ප්‍රසාරණය සම්බන්ධය.ස්නායු විද්යාවේ ප්රවණතා.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).